siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

有糸分裂中に発生する細胞組織と染色体動態の変化は、ゲノムおよび細胞内容物の正確な遺伝を確保するために緊密に調整されています。このビデオ記事では、有糸分裂の特徴イベントを追跡する方法が示されています。染色体の動きは、蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞株を使用して、個々の細胞ベースでモニタリングされます。

irnaによるトランスフェクションは、有糸分裂タンパク質に対して向けられ、細胞周期の変化をもたらし、タイムラプスイメージングで視覚化し、画像解析で定量化することができます。こんにちは、ユタ大学ハンツマンがん研究所のケイティ・オマーン研究室のダグラス・マッキーです。本日は、SIAトランスフェクション後の有糸分裂を進行する生細胞をイメージングする手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、目的のタンパク質の破壊が有糸分裂進行のタイミングに及ぼす可能性のある影響を研究しています。それでは始めましょう。それぞれに0.5ミリリットルのフィブロネクチンを追加して、4つの壁のラボテック2チャンバーカバーガラスを準備します。

室温で10〜15分間インキュベートします。それまでの間、リバーストランスフェクション用のirnaおよびlip RNAI max複合体を調製します。各チャンバーの製造元の指示に従って、24ウェルディッシュの1ウェルに推奨される量をよく使用してください。

15分後、チャンバーカバーガラスのウェルからフィブロネクチンを取り出します。次に、100マイクロリットルのirna複合体を各ウェルに20, 000個の細胞をそれぞれに500マイクロリットルで分注します。細胞をインキュベーターに24時間よく置きます。

翌日、トランスフェクション混合物を1ミリリットルの通常の細胞培養培地と交換し、画像取得のさらに24時間前に細胞をインキュベートします。画像取得のセットアップは、倒立顕微鏡のステージに収まるカスタマイズされたセルインキュベーターで構成され、画像取得ソフトウェアによって制御されます。画像取得の準備をするには、インキュベーターが事前に警告され、平衡化されていることを確認してください。

次に、インキュベーターの蓋を開け、チャンバーの蓋をした状態で細胞をアダプターに入れます。モデリングクレイを少量使用して、所定の位置に保持します。蓋を閉め、インキュベーター全体を顕微鏡ステージに配置し、インキュベーターがしっかりと固定されていることを確認します。

次に、metamorphを使用して、ソフトウェアのメニューバーでアプリの多次元取得を選択して実験を設定します。これにより、イメージングパラメータを選択できるウィンドウが表示されます。データファイルの保存場所を指定します。

次に、4つのTX乾式位相コントラスト対物レンズを使用して明視野とmチェリー波長を選択し、ソフトウェアを使用して細胞のフィールドに焦点を合わせ、明視野チャネルのみのオートフォーカス機能を調整します。これにより、ソフトウェアは各取得前に各ステージ位置でオートフォーカスを行うことができます。最初の波長では、画像をキャプチャします 50ミリ秒の露出を使用して、良好な画像を表示するために必要な最小の露出時間を調整します。

細胞の生存能力を維持するためには、光への曝露量を制限することが不可欠です。原則として、これは減光フィルターを使用し、カメラの露出時間を長くすることで実現できます。むしろ、照明強度を上げることによって。

追加の波長に対してこの手順を繰り返します。次に、各チャンネルの露光時間を設定します。次に、15ステージの位置で8時間、15分のタイムラプスインターバルを指定します。

より長い時間分解能が必要な場合は、集録の時間間隔を短くします。ステージポジションの使用が多いほど、取得にかかる時間が長くなることに注意してください。各時間間隔で、細胞集団を適切にサンプリングするために、適切な数のステージ位置を選択してマークします。

Metamorはポジションを記録し、取得ごとに指定された場所に戻ります。タイムラプス波長露光後、時間位置情報とステージ位置情報が指定されています。プレビューを選択しますview 画面上のボタンを使用して、ソフトウェアが機器を適切に制御していることを確認します。

システムが機能していることを確認したら、画面上の取得ボタンを選択して取得を開始します。少なくとも 1 回のフル ラウンドのアクイジションを通じて自動化を観察し、すべてが正しく機能していることを確認します。次に、座って、コンピューターと顕微鏡が作業を行うのを待ちます。

データを確認するには、アプリを選択し、メニューバーで多次元データを確認し、ファイルの場所ビューを選択してから、ステージの位置を選択します。[画像の読み込み] をクリックして、その位置からの画像のスタックを確認します。画像が読み込まれたら、マウスを使用してデータをフレームごとに進めます。

ここでは、メタモルフを使用して有糸分裂細胞の動画を生成します。Metamorphでムービーを作成するには、スタックメイクムービーを選択します。メニューバーで、使用するフレーム、ムービーの速度、およびファイルタイプを選択します。

次に、[保存] を選択してモンタージュを作成します。まず、データをmetamorphでドットSTKファイルとして保存します。次に、画像Jを開く:画像Jでドットのstkファイルを開き、領域をマークしてメニューバーで画像の切り抜きを選択して、関心領域を切り抜きます。

次に、画像スタックを選択します。[モンタージュを作成] モンタージュのサイズと形状を含めるフレームを指定します。また、フレームの境界線間が望ましいかどうか。

その後、OKを押します。モンタージュをドットtiffファイルとして保存します。最後に、有糸分裂の各段階で時間を計算し、Tがゼロ前期に等しいため、DNA凝縮または細胞の丸めの最初の兆候が明らかなフレームを指定します。

前中期は、染色体が赤道で整列すると終了し、その後、DNAが後期終期を分離し始めるまで中期が進行します。そして最後に、細胞質分裂が続き、細胞が平らになり始めます。彼の石を発現する肺門細胞のタイムラプスイメージング。

H 2つのBCFPが示されています。これらの細胞は制御irnaでトランスフェクションされ、細胞周期を通じて正常に進行しました。これに対し、核孔NUP 1 53に対するsiRNAをトランスフェクションした細胞は、MITの進行における重篤な変化を転移します。

フェクション後の細胞の有糸分裂進行のタイミングを決定するために、タイムラプスイメージング実験を設定、実行、分析する方法を示しました。この手順を行うときは、適切な温度とCO2濃度を維持し、細胞がさらされる光の量を制限することにより、細胞にできるだけ優しくすることが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。