プラスチック製の埋め込みとアフリカツメガエル胚のセクショニング

プラスチック製のセクションでは、組織の多くの種類のパラフィン包埋や凍結切片より、この方法は、より有用に、蛍光二次抗体で免疫染色することができる組織の薄切片における真の組織形態を維持する。染色、プラスチック製の埋め込み、およびセクショニングするための方法はこのビデオで示されている。

こんにちは、ソチオタと申します。私は、カリフォルニア大学発生細胞生物学部の趙健博士の研究室で博士研究員として働いています。Irv I 今日は、xenopus embryoのsimpl切片の調製をお見せします。

この手順には、目的の分子に対する抗体で染色した後期ガス期のカエル胚の二切片をプラスチックに浸潤させ、5ミクロンの同じプラスチック切片を作ることが含まれます。この手順は、免疫蛍光免疫組織化学の研究や、非常に高解像度の画像を用いたin situハイブリダイゼーションの研究に利用できます。さて、これらは私が10プラス胚の胚プラスチック切片化に使用するための小さな便利なツールです。

これはデルタチップ付きの金属ピンセットで、これは1番で、プラスチックで胚を向き付けるために使用できます。そして2つ目は、このペイントブラシと一緒に使用して、胚をミクロトームから取り付け面に移すことができます。これはシリコンゴム製の絶縁体で、スライドの表面に置き、プラスチック切片の胚のスライスを取り付けるために水を引っ張るようにします。

今、私はnstituteハイブリダイゼーションや免疫蛍光検出のようなアッセイのための胚、固定胚を二等分する方法を示しています。そして、胚の半分を切るために、食料品店で買えるこの非常に薄いデザートグリッドを使用しています。はい、一晩で細胞を3.7%のフォーマルな高値に固定する固定胚があると思います。

そして、それはあなたがそれをどのように修正するかは目的に依存します。これは一晩で修正されます。切開ハイブリダイゼーションの目的では、一晩固定することができますが、胚の内部のタンパク質を検出する免疫蛍光検出では、あまり長い固定はお勧めしませんでした。

また、タンパク質の細胞内局在への影響を最小限に抑えるために、また検出ステップ中に抗体がうまく浸透できるように過剰固定を避けるために、3.7%フォームの高さ固定を2時間だけ行います。さて、今、私はこの胚をブラストウォールを通して左側と右側を切り取って解剖しています。だから今、私はこれがPOが背側から腹側までずっとあるステージ11の胚を持っていることがわかりますが、バイ胚です。

そして、この右手の駒を見てみましょう。背側と腹側の両方にブラストポが見えますが、この陥入は腹側に比べて胚の最も深い、深いところまで明らかに到達しているため、背側は明らかです。ですから、これは背側と腹側の両方を研究するための良い二等分された作品です。

この胚の内部では、この解剖した胚を、胚の内部で発現したタンパク質の免疫蛍光検出を用いてみます。また、免疫蛍光法や免疫組織化学法では、抗体特異的抗体を検出に使用します。しかし、問題は、抗体が胚の内部にあまり浸透しないことです。

ですから、ホールマウント、ホールマウント胚を使っても、知ることはできません。胚でタンパク質の発現パターンを研究することはできません。しかし、この二分前胚を使用すると、胚の深部にある細胞内の発現パターンが何であるかを調べることができます。

ああ、染色された胚は、エタノールで脱水された3.7%ホルムアルデヒドですでに固定されており、テクノ7、100と呼ばれるプラスチックに浸透しています。そして、このキットには、この主要部分の液体と、硬化剤と呼ばれるこの粉末の3つの部分が含まれています。そして、この液体は硬化剤2と呼ばれています。

まず、この主要部分と硬化剤を100対1のレイオで混ぜると、この浸透ミックスが得られます。そして、それが液体であり、私はこの胚に浸潤しているのです。そして、これはまだ液体なので、まだ固まることはありません。

そして、これは、胚サンプルがこのプラスチックに完全に要約されていることを確認するために、この浸潤混合物に一晩放置される胚サンプルです。次に、このサンプル胚の1つをトランスファーピペットで取り出し、薄肉の0.5 MPCLチューブに移し、包埋型として使用します。それからこの胚から私は余分な液体を取り除きます。

そして今、この胚、この胚はすでに硬化プラスチックに埋め込む準備ができています。硬化プラスチックを作るには、この浸透混合物とこの硬化チューブを15対1で混合します。例えば、この浸透混合物を750マイクロリットルでオフチューブの下支えにすると、この硬化剤も50マイクロリットル加えて、プラスチックの重合を開始することになっています。

また、酸素は重合反応の阻害剤であるため、ボルテックスを行うべきではありません。この混合物の約250マイクロリットルを胚に加えます。そして、この重合ステップは、あなたがすべきであるのにほぼ4時間かかります、あなたは全く急ぐ必要はありません。

この重合プラスチックを最初に追加した後、それを上下にパイプでつなぎ、胚をプラスチックに浮かせることができます。そして今、私はこのED金属ピンセットを使って胚の周りを押し、胚の切断面がこの埋め込み型の底に来るように胚の向きを変えます。その後、酸素は硬化反応の阻害剤であるため、キャップを閉め、4時間放置して反応させます。

その後、これはすでにサンプルに群れているHUDです。このサンプルに接着剤のようなものを付けて、このプラスチックの硬い部分がこの型から出ないようにします。これは、これはテクノ30 40と呼ばれるこの目的の接着剤として機能する別のプラスチックです。

そして、この粉末と液体を2、2、1と混ぜているのは、この粉末の0.6グラムです。そこで、この液体を300マイクロリットル加え、すぐに混ぜると、このプラスチックはすぐに固くなります。つまり、これはパートで、少し硬くなってから、すでに聞いたこのサンプルにこれを注ぐ必要があります。

これで十分です。キャップを閉めます。こんな感じです。

そして、これが固くなるまでに約30〜60分かかります。そして、これは行動を起こす準備ができているものです。まず、型先を段ボールナイフで切り取り、この先端部分をこの型から剥がします。

したがって、この埋め込まれた胚が露出しています。また、このキャップは必要ないので切り落としました。今、私はこのtain Royの針を取ります、私はパリン切片に使用される通常のステインブレードよりも硬い針のtain Royの刃ではありません。

これをXinに少し浸してきれいにします。をにセットし、これをブレードホルダーにセットして、余分なゼインを拭き取ります。そして、時々、このエリアの清潔さが絶対に重要であるため、このエリアもゼインで掃除します。

これで、セクショニングの準備が整いました。セクショニングを始める前に、取付室を設置します。これがスライドガラスです。

そして、これに加えて、私はこのシリコーンゴムを入れて、ファーマーをずっと押して、漏れないようにしています。そして、これを滑り台ウォーマーの上に置き、このきれいな薬水を注いでプールを作ります。そして、水面水面を得るまで、できるだけ多くの水を入れて得るようにします。

そして、この洪水の水面は水の表面張力を均等に分布させ、セクションを均等に伸ばすために重要であるため、これは重要です。今はセクショニングをしていますが、その前にこのマスクをかぶっているのは、セクショニングの各ピースがとても軽く、とても軽く、私の胸がステージから吹き飛ばされてしまうからです。だから、このマスクをかぶっています。

そして、セクショニングを始めましょう。ステージ上にいくつかのセクションピースが揃った後、これをペイントブラシで取り、この山の部屋の上にゆっくりと移動し、このペイントブラシをたたくと、それらのピースが重力によって水に入るようにします。そして、水に着地するとすぐに、水面に円形のピースを形成するために伸びます。

一晩乾かした後の光はどうですか。今はこんな感じとこんな感じです。これで、サンプルは核DNAのDPIと接触する準備が整いました。

そして、顕微鏡で勉強することができます。今日は、後期ガス期のカエル胚を用いたプラスチック切片の作製をお見せしました。この手順は、パレン包埋技術を使用して研究することができないタンパク質のサブセルまたは局在を研究するために非常に有用であり、また、これは一般的に残留ハイブリダイゼーションに対しても有用です。

このプラスチックセクションはまた、残留ハイブリダイゼーションのためにも、この手順はあなたにパレンまたは凍結セクションサンプルよりもはるかに高いレベルのそれらの画像を与えることができます。