Name: β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42までと誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学ぶβ-アミロイド1-42オリゴマーの調製法。HFIP処理、DMSO再懸濁、リン酸緩衝液でのインキュベーションを経て、海馬スライスのシナプス可塑性障害を誘導する方法を解説。アルツハイマー病研究と創薬スクリーニングに応用可能。

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この作業は、神経疾患や脳卒中のNIH国立研究所（NINDS）（NS049442）によってサポートされていました。&gt;

再懸濁β-アミロイドペプチド始める前には用意しておいてください。 <ul><li> Aβ1-42（凍結乾燥粉末） </li><li> 1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール（HFIP） </li><li>低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を</li><li>テフロンのプランジストップ付気密ハミルトンシリンジ（250μl）を</li><li>ジメチルスルホキシド（DMSO） </li></ul><ol><li>凍結乾燥Aβ1-42は、ペプチドバイアルを開くときに結露を避けるために、30分間室温で平衡させる。 </li><li>ヒュームフードの下で、1 mM溶液と数秒間ボルテックス解を得るために、氷冷HFIPにAβ1-42ペプチドを再サスペンド。 </li><li>テフロンプラグ付ガラス気密ハミルトンシリンジを使用して、迅速に等しくthreeポリプロピレンバイアルにAβ1-42 / HFIPソリューションを分割し、バイアルを密封する。 </li><li>バイアルは、Aβmonomerizationを可能にするために2時間インキュベートする。次に、バイアルを開いて、明確なペプチド膜がバイアルの底部に観察されるまでSpeedVac遠心分離機（800グラム、室温）を用いて真空下でAβ1-42 / HFIPのソリューションを集中する。 （最大25 ° C）ペプチド分解を避けるために、Speed​​Vac遠心分離機内部に慎重に温度を確認してください。 </li><li>バイアルを密封し、-80アリコート℃にて保存してください。 Aβフィルムは、6ヶ月間保存することができます。 </li><li> 5mMのAβ1-42までの濃度を得るためにDMSOを添加して1フィルムを再懸濁する。再懸濁を完全に保証するために10分間水浴中に超音波処理。 </li><li>ポリプロピレン製バイアルに分注しこの5mMのAβ1-42のソリューション。すべてのバイアルを密封し、-20℃で保管しますアリコートを解凍は1回限りです。冷凍庫内の水の結露について。溶液中のペプチドは、非常に容易に低下する。 </li></ol>オリゴマー化始める前には用意しておいてください。 <ul><li> Aβ1-42 / DMSO（5mm）で</li><li>滅菌リン酸緩衝液</li><li>低結合ポリプロピレン製微量遠心チューブ（1.5 ml）を</li><li>低結合ポリプロピレン遠心チューブ（50ml）を</li></ul><ol><li>滅菌リン酸緩衝液（最大100μl）を、得られた5mMのAβ1-42 / DMSOのアリコートを希釈する。 </li><li>その後30秒間ボルテックスし、4℃で12時間インキュベート° C </li></ol>海馬スライスの治療海馬スライスを治療する際に、それはビーカー、灌流チューブの表面、および記録室への非特異的ペプチドの付着を回避することが重要です。優先的に低結合ポリプロピレンチューブと容器を使用してください。ガラスまたはプラスチック製のウェアのジェネリックの使用は避けてください。潅流媒体は、血清またはアルブミンフリーでなければなりません。 Aβ灌流始める前には用意しておいてください。 <ul><li>オリゴマーAβ1-42 </li><li>録音バッファ（mMで：124のNaCl、4.4 KClを、1のNa 2 HPO 4、25のNaHCO 3、2のCaCl 2、2のMgCl 2、および10グルコース） </li><li>インタフェースのチャンバーとセットアップ電気生理学的記録</li><li>少なくとも90分後の解剖のために酸素を記録バッファー中でインキュベート横海馬スライス（T = 29℃、一定の血流速度は= 2ml /分） </li></ul><ol><li>実験の直前に、事前に酸素記録バッファとポリプロピレンチューブに適切な作業の濃度（200nMのまたはそれ以上）にオリゴマーAβ1-42アリコートを希釈する。 </li><li>シナプス可塑性の誘導の前にスライス〜20分間、Aβ1-42のソリューションを灌流。 </li></ol>可塑性の誘導とフォローアップ<ol><li>通常は、シナプス可塑性の最も広く使用されているモデルはLTPです。それは、海馬内の特定のシナプスのテタヌス刺激によって誘導することができる。我々は、シェイファーの担保の予測と地層のradiatumのCA1錐体ニューロン間のシナプスからフィールドの応答を記録。私たちのテタヌス刺激は15秒間隔で区切られた3列車を含むシータバースト刺激で構成されています。各列車は、各バーストは、100Hzで5パルスを伴う5Hzで10バーストで構成されています。オリゴマーAβの血流が完了した直後にテタヌス刺激を適用します。 </li><li>すぐにテタヌス刺激後に通常の録画用緩衝液で灌流に戻ります。実験期間を通じて一定の灌流速度、記録室の温度と適切な酸素化を維持する。 </li></ol>代表的な成果と可能性のある問題スタインらcollの古典的なプロトコル。1に記載のオリゴマーAβは、Aβモノマーとの様々な異なるサイズのオリゴマーを生成するS（二量体、三量体、など）オリゴマーの血流制御のスライスと比較してAβ処理のスライスに減少LTPにAβ1-42リード。コントロールのスライスでLTPの値が存在するあいだは3〜5ヶ月のC57BL/6J雄性マウスを使用している我々の実験条件の下で、LTPは200 nMでAβ処理のスライスは、テタヌス刺激後2時間におけるベースライン値の平均150パーセントになりますbaseline2の平均200から250パーセントで。いくつかのケースでは、Aβによる治療は、海馬LTPを減らすために失敗することがあります。発生する可能性のあるいくつかの重大なエラーは、Aβ濃度と不完全なオリゴマー化の間に乾燥過度のフィルムが含まれています。海馬切片におけるAβ灌流は、懸念のためにプラスチックに非特異的な接着が起こりやすいソリューションのAβペプチドの物理化学的性質の別のソースかもしれません。これらの問題のトラブルシューティングについては後述する。

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

動物実験は、コロンビア大学IACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

上述したように、オリゴマーAβの準備にはいくつかの問題が健常LTPになることがあります。 Aβ分解またはAβオリゴマー化の欠如が発生した可能性がありますかどうかを評価する一つの方法は、トリス - トリシンPAGE /ウエスタンブロット分析および分析超遠心を（このプロトコールに記載されていません）を使用してAβの準備を評価することです。ウェスタンブロッティングのサンプルがnon-denaturing/non-reducing条件下で調製されている場合、成功する準備はモノマーと異なるオリゴマー3に対応するバンドをフィーチャーしたウェスタンブロッティング署名を生成する必要があります。頻繁に発生する問題は、Speed​​Vacコンセントレータの乾燥工程中のペプチド不安定です。実際には、高温乾燥は、茶色に顕著なペプチドの着色によって顕著な、蛋白質の劣化につながります。 HFIP溶液の濃度は、室温で実施し、注意深く監視する必要があります。プロトコルで発生するいくつかの操作手順を与え、希釈のエラーが誤って悪いオリゴマーまたは誤解を招くようなAβ濃度につながる可能性があります。興味深いことに、提案されたよりも低いAβ濃度と血流が増...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42 (凍結乾燥) </td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>50mL ポリプロピレン遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml MaxyClear マイクロチューブ（最大回収用）</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>GASTIGHT シリンジ 250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>バス型超音波洗浄機</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 濃縮装置</td><td>Various</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

シナプス結合の減損は、アルツハイマー病（AD）の初期段階で発生する微妙な健忘の変化の根底にある可能性があります。 β-アミロイド（Aβ）、ADで多量に生産さペプチドは、細胞が学習と記憶の相関長期増強（LTP）を、減少させることが知られている。確かに、Aβに起因するLTPの障害は、ADのモデルで、そのようなシナプス障害を軽減または復帰が可能なスクリーニング薬のシナ​​プス機能障害を研究するための有用な実験パラダイムである。研究は、Aβがそのオリゴマーフォームを経由して優先的にLTP混乱をもたらすことが示されている。ここでは、オリゴマー合成の灌流による急性海馬スライスにAβ1- 42ペプチドを損なうLTPの詳細なプロトコルを提供しています。このビデオでは、我々はオリゴマーAβの調製のためのステップバイステップの手順を概説<sub&gt; 1から42まで</sub&gt;。その後、我々は、LTPがオリゴマーAβに曝露した海馬スライスに低減されている個々の実験に従ってください<sub&gt; 1から42まで</sub&gt;無Aβ対照実験でスライスと比較して<sub&gt; 1から42まで</sub&gt;露出が発生していた。

アルツハイマー病の特徴のひとつは、Aβの上昇です。<sub&gt; 1から42まで</sub&gt;ペプチド。ここでは合成Aβを製造するためのプロトコルを提供<sub&gt; 1から42まで</sub海馬長期増強、記憶の相関、細胞を損なう&gt;オリゴマー、。この手順では、Aβ誘発性病態と薬剤スクリーニングのメカニズムを調べるのに便利です。

シナプス結合の障害は、アルツハイマー病（AD）の初期段階に生じる軽微な記憶障害の根底にあると考えられています。

合成beta amyloid 1-42をHFIPに再懸濁してペプチドを単量体化し、その後、リガンド化のためにフィルム状になるまで濃縮します。このフィルムをDMSOに再懸濁し、リン酸緩衝液で希釈して一晩インキュベートします。最終的に、オリゴマーペプチドを記録緩衝液で希釈し、急性海馬スライスに灌流させ、シナプス可塑性に対する有効なbeta amyloid曝露の影響を評価します。ニューヨーク市にあるコロンビア大学のAvio Orioの研究室へようこそ。今日は、2003年にSteinらによって最初に提案されたプロトコルに基づき、当研究室で最適化したオリゴマー型βアミロイドの調製手順をご紹介します。当研究室では、アミロイドβによって誘発されるシナプス機能不全を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。バイアルを開封した際の結露を防ぐため、凍結乾燥ベータアミロイド粉末のバイアルを30分間室温に戻します。バイアルを開け、氷冷したHFIPを加え、ベータアミロイドの最終濃度を1 mMにします。バイアルを密閉し、ボルテックスで混合します。ハミルトンシリンジを用いて、溶液を3本の低吸着ポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに等量ずつ迅速に分注します。チューブを密閉し、室温で2時間インキュベートしてペプチドを混合させます。チューブを開け、スピードバック（真空濃縮機）に入れて溶液を濃縮します。真空状態で800 Gsで約15分間遠心分離します。タンパク質の分解を防ぐため、温度が25 °Cを超えないように注意してください。チューブの底に透明で乾燥したペプチド膜が確認できれば、遠心分離は完了です。膜が見えにくい場合があります。チューブを密閉し、未使用の分注分は-80 °Cで最大6ヶ月間保存してください。DMSOを用いてペプチド膜を最終濃度5 mMまで再懸濁し、ウォーターバスで10分間ソニケーションを行います。ペプチドの完全な再懸濁を確実にするため、5 mMのβアミロイド溶液を1.6 µLずつ分注し、-20 °Cで保存します。各分注サンプルは1回のみ解凍してください。実験前日に、5 mM βアミロイド溶液の分注サンプル1本を解凍し、滅菌リン酸緩衝液98.4 µLを加えて最終容量を100 µLにします。30秒間ボルテックスし、4 °Cで12時間インキュベートします。凝集を開始させ、実験に供するために、新鮮な海馬溶解液を90分間インキュベートします。標準記録緩衝液を用いて、刺激電極をシェーファー側枝に、記録電極を放散層に配置します。反応が確認され、10分間ベースラインが安定したら、すべてのall liga beta amyloidを200 nano molarに希釈します。記録緩衝液中ではbeta amyloidがガラスに非特異的に結合するため、可能な限りプラスチック製器具を使用してください。ベータアミロイド溶液をスライスに20分間灌流させます。好みのトーンX刺激を与えてください。例えば、テタヌス刺激の直後にシータバースト刺激を行い、通常の記録バッファーによる灌流に戻します。テタヌス後、少なくとも2時間は記録をモニターし、LTPの誘導を確認して、βアミロイド処理の影響を観察してください。ここでは、海馬スライスにおけるシナプス可塑性の障害を誘導するための、オリゴマー化させたβアミロイド1-42の調製方法を説明しました。この手順を行う際は、ペプチドフィルムを乾燥させすぎると、凝集（アグリゲーション）が不完全になる可能性があることに注意してください。また、ペプチドの非特異的結合を防ぐため、ベータアミロイド溶液にはプラスチック製品を使用することが極めて重要です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

preparation-oligomeric-amyloid1-42-induction-synaptic-plasticity

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