ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

本実験の全体的な目的は、生きたゼブラフィッシュ胚において、化学的にケージ化された蛍光色素などの光応答性剤を、単一細胞の解像度で光活性化させることです。これは、光応答性剤を1細胞期の胚に注入し、生体内の遺伝的標識を発現させることで、目的の細胞を特定し、正確に標的化することで達成されます。次のステップとして、胚を成長させ、低融点アガロースに埋め込んで固定し、生きた胚を不動化します。

次に、2光子顕微鏡を用いて、可視蛍光トランスジェニック・ランドマークを局在化させます。その後、目的の焦点面で光応答性薬剤を活性化させ、光活性化の範囲をモニターします。これにより、標識された細胞のその後の運命を、後続の胚発生段階で追跡することが可能になります。

この手順は、生体試料において単一細胞解像度でさまざまな化合物を活性化させるために利用できます。共焦点顕微鏡やフラッシュランプなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、比較的低い光毒性で、数ミクロンの軸方向レベルで比較的深い組織の光活性化が可能であることです。本手法はセラインエッジトレーシングに使用されますが、さまざまな成分の光活性化にも適用でき、それによって発生および生理学的プロセスの標的制御が可能になります。注入の前夜に交配タンクを準備し、可視蛍光ランドマークを発現しているトランスジェニックラインのゼブラフィッシュのオスとメスを分けておきます。

この実験では、神経原性N1プロモーターの制御下でGFPを発現するトランスジェニック系統を使用します。0.2 M塩化カリウム中に溶解した5%デキストラン結合ケージドフルオレセインの分注量を氷上で解凍します。ケージドフルオレセインを0.2 M塩化カリウムで希釈し、最終濃度を1%にします。フルオレセインは氷上に保持し、遮光してください。ゼブラフィッシュを交配させ、産卵後すぐに受精卵を回収し、本文に記載の方法で洗浄します。プラスチックピペットを使用して、解剖顕微鏡下で、新鮮なE3培地を満たした1%アガロース注入プレートに1細胞期の胚を移動させます。

ピペットを使用して、胚を注入用溝（インジェクション・トラフ）内で適切な向きに調整します。長くテーパー状に引いたキャピラリー注入針の先端を切り離します。マイクロローダーチップを用いて、針に約1 µLの1% caged fluoresceinを後方から充填します。

充填済みのニードルを、空気圧式マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。各胚の細胞質に、2〜3 nanoliterのケージドフルオレセインを直接注入します。1回の実験につき、少なくとも50個の胚に注入してください。

注入後の胚を新鮮なE3培地を含むペトリ皿に移し、色素沈着を抑制するため、目的の発育段階に達するまで28.5 °Cで暗所培養します。胚のマウント準備のため、受精から24時間後の胚に0.1% Phenylthreaを添加します。15〜20枚の60 mmペトリ皿に、新鮮なE2培地に溶解させた1% Agaroseを薄くコーティングし、Agaroseが凝固した後、解剖顕微鏡下で皿にE2培地を満たします。

鋭いピンセットを使用して、注入した胚をコーティング済みのプレート上に配置します。胚が空気に触れないように注意してください。水で希釈した2%低融点アガロースの分注液を用意しておきます。

72°Cに設定したヒートブロック内で操作します。火炎滅菌したパステールピペットを用い、約150µLの培地に含まれるコーティング済み胚1個を60mmペトリ皿に移します。胚の横に同量の2% agaroseを滴下し、2つの液滴を素早く混ぜ合わせて均質な1% agaroseの液滴を作成します。

胚の背側が対物レンズに向くように配置します。アガロースを凝固させ、包埋した胚をE2培地に浸します。広帯域ターンテーブルレーザーを備えた2光子顕微鏡下のプレートホルダーに、マウントしたばかりの胚を設置します。

光活性化プロセスを開始する前に、発現組織の最も腹側から背側の端まで、860 nmで画像シリーズを取得します。Z平面上の画像間隔は6 µmとしてください。光活性化のターゲットとなるZ平面を選択し、GFPを指標としてピントを合わせます。

関心領域を特定します。860 nanometersで画像を1枚撮影し、正確にアライメントを行うために、その画像を別ウィンドウで開いたままにしておきます。edit bleachメニューを開く前に、720 nanometersのレーザーがモードロック状態にあることが極めて重要です。

860ナノメートルで撮影した画像を使用して、光活性化の関心領域（ROI）を定義します。エディットブリーチウィンドウで、相対レーザー出力、反復回数、およびスキャン速度を調整します。光活性化を行うには、レーザーが停止したときに「bleach」を押し、860ナノメートルに戻して単一平面画像を撮影し、得られた光活性化物質の強度を評価します。

活性化領域のz-scanまたは厚さを評価するために、イメージスタックを収集します。これにより、レーザー強度と露光時間を経験的に決定することが可能です。各クローンまたはクロスフォトを最適に光活性化させるために、実験に使用する残りの胚をすべて活性化させてください。

これらの条件下で、マウントした光活性化胚を、0.1% Phenyl thio ureaを含むE2培地を用い、28.5 °Cの暗所で目的の発生段階に達するまで育成させます。解剖顕微鏡下で、尖ったメスを使用して、マウントした胚の近くの脈絡膜（chorion）にV字型の切り込みを入れます。このとき、切り込みの底が胚の頭部を向くようにします。切り込みの箇所に、閉じた状態のピンセットを配置します。

ピンセットをゆっくりと開き、胚の長さに沿って卵膜を分離させて、胚を培地中に放出させます。各胚を放出した後、火炎滅菌したパストゥールピペットを用いて、マイクロ遠心チューブに回収します。ドラフトチャンバー内で、4% formaldehydeを用いて胚を3時間固定します。

室温で、付属テキストの記載に従い、脱水、再水和、アルカリフォスファターゼ標識抗フルオレセインによる染色、およびすべての関連洗浄操作を行う。ろ過済みのfast red溶液500 µLを胚に加える。室温の暗所でインキュベートし、目的のシグナル対ノイズ比に達するまで、1時間ごとに新しいfast red染色液に交換する。

PBSTで5分間ずつ3回洗浄し、染色反応を停止させます。ドラフトチャンバー内で、4%ホルムアルデヒドを用いて20分間染色の固定を行います。その後、PBSTで5分間ずつ2回洗浄します。

透明化した胚を、PBSで調製した25%、50%、75%の段階的なグリセロール濃度勾配で洗浄し、各胚がチューブの底に沈殿するまで行います。顕微鏡での観察準備が整うまで、胚を4°Cで保存します。観察のために胚をマウントするには、1 mLシリンジを使用して、顕微鏡スライド上の15 mm四方の四隅に、20 µLの透明シリコングリスを4箇所に点状に塗布します。

グリースの液滴の間に、約200 µLの75% glycerolを入れた胚を配置します。胚の上にカバーグラスを置きます。グリセロール溶液が満たされるまで、カバーグラスをゆっくりとまっすぐに押し下げます。

グリースで固定した胚の液滴間のスペースは、共焦点顕微鏡で観察するまで、4 °Cで数日間保存することができます。この画像は、neurogenin 1 プロモーターの制御下で GFP を発現している生きたゼブラフィッシュ胚を示しています。この胚には、前述の方法を用いて、1細胞期にケージドフルオレセイントレーサー色素が注入されており、現在は3〜5ソマイト期です。

前脳原基の離散的な領域を2光子レーザーで光活性化し、脱ケージ化されたフルオレセイントレーサー色素を検出しました。光活性化操作の後、胚を28.5 °Cでインキュベートし、受精後24時間目に、脱ケージ化フルオレセインを含む脳細胞を抗フルオレセイン免疫染色により赤色で追跡しました。ラベル化された細胞数が少ないことに注意してください。光活性化の手順に習熟すれば、わずか数時間で実施可能です。この手順を行う際は、単一細胞レベルの解像度で精密な光活性化を可能にするため、最適なパラメータを制御することが重要です。