ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する
April 29th, 2010
ヘッドオンRNAポリメラーゼ（RNAP）との衝突に続くreplisomeの運命は不明である。我々は、DNAからRNAポリメラーゼを置換した後、伸長をreplisomeヘッドオンRNAPとの衝突時に屋台が、再開することを見つける。 MFDは、衝突後のRNAPの変位を容易にすることによって、レプリケーションの再起動を促進する。
この手順の全体的な目標は、正面衝突後のRepliゾーンとRNAポリメラーゼまたはRNAPの運命を観察することです。これは、まず転写複合体をビオチン化DNA上に組み立て、それをStripp錠剤とビーズに固定化することで達成され、その結果、RNAP伸長複合体が停止します。手順の2番目のステップは、pre-needフォークDNAをRNAP伸長複合体にライゲーションして、ヘッドオンRNAの下流に複製フォークを形成することです。
手順の 3 番目のステップは、応答ゾーンをアセンブルし、レプリケーションフォークでリーディングストランド合成を開始することです。手順の最後のステップは、磁気ビーズからDNAを分離し、PCRクリーンアップカラムでDNAを精製することです。最終的には、精製された放射性標識DNA産物のアルカリ性アグロゲルを介して、正面転写複合体と衝突するとロソが失速することを示す結果を得ることができます。
こんにちは、ロックフェラー大学のマイク・オドネル研究室のリチャード・ポメランスです。今日は、固相でリボソームとヘッドオンRNAポリメラーゼの衝突を行う手順を示します。私たちの研究室では、この手順を使用して、複製のプロセスがDNAに沿った転写複合体によってどのように影響を受けるかを研究しています。
それでは始めましょう。このプロトコルミックスを開始するには、100マイクロリットルのバッファーA中にT seven A oneプロモーターを含むビオチン化3.6 KB DNAテンプレートを持つRNAPホロ酵素を、混合物を摂氏37度で10分間インキュベートします。10分間のインキュベーション後、リボヌクレオチドのアデノシン、三リン酸、シチジンリン酸、およびAden対立遺伝子ウリジンを添加すると、RNA合成が20ヌクレオチドに制限されます。
溶液を摂氏37度でさらに10分間インキュベートし、停止したRN類人猿伸長複合体をビーズに固定します。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズに溶液を添加します。混合物を室温で10分間インキュベートします。
固定化された停止したRNAP伸長複合体を、0.9ミリリットルの高塩緩衝液でビーズを洗浄することにより精製します。非特異的な R-N-A-P-D-N-A 錯体を洗浄のたびに除去するには、磁気分離によって上清を除去します。この洗浄を5回繰り返す必要があります。
その後、ビーズは、バッファーA.Afterの0.9ミリリットルでさらに2回洗浄する必要がありますが、最終的な洗浄後、下流のレプリケーションフォークは、ヘッドオンRNAPのResusの下流のレプリケーションフォークを形成するために組み立てることができます、ニューイングランドバイオラボのバッファ4の100マイクロリットルで停止したRNAP伸長複合体に付着した明らかなビーズに磁気ストリップを中断します。次に、エビアルカリホスファターゼまたはSAPホスファターゼ10単位を加え、サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートします。0.9ミリリットルの緩衝液Aでビーズを3回洗浄し、その後、ビーズを50マイクロリットルのクイックTフォーライゲーション反応緩衝液に再懸濁します。
2マイクロリットルのQuick T 4リガーゼとフォークDNAを事前に添加し、溶液を室温で10分間インキュベートします。最後に、0.9ミリリットルのバッファーAミックス六量体、磁性連鎖球菌Aを含むDNABヘリカーゼ、および停止したRNAP伸長複合体と下流の複製フォークに付着したビーズでビーズをさらに3回洗浄します。溶液を150マイクロリットルの緩衝液Aに調製し、摂氏23度で30秒間インキュベートします。
摂氏23度での短い32回目のインキュベーションに続いて。ポリメラーゼ3ベータクランプでは、A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-Pα P 32はDGTPを標識し、αP 32はDATPを200マイクロリットルの容量に標識しました。サンプルを摂氏37度で5分間インキュベートします。
一本鎖DNA結合タンパク質DCTPおよびDTTPを添加することにより、複製を開始します。また、DTTPおよびDCTPとラベル付けされたαP 32を最終容量250マイクロリットルに加えます。10分後、12マイクロリットルの0.5モルEDTAを追加して反応を終了します。
次に、strp dinビーズを沸騰させて、ビーズからDNAを放出します。ビーズをプロテイナーゼKで摂氏50度で30分間処理することにより、残留DNAを除去します。ビーズを再度沸騰させ、磁気分離により上清を取り除きます。
DNAを含む結合上清を狂言PCRクリーンアップキットを用いて精製します。最後に、精製されたラジオラベルDNA製品をアルカリ性アルスゲルで分析します RNAP上のヘッドとゾーンの衝突は、通常、長さが2.5KBと3.6KBの2つの製品になります。2.5 KB の製品は、フォークから停止した RNAP までの DNA の長さを表しています。
これは、RNAPとの衝突時に応答が失速することに起因します。3.6 KB の産物は、完全長 DNA を表し、RNAP によるプロモーターの不完全な占有率、またはヘッドオン RNAP の部分的な応答リードスルーのいずれかの結果です。良好な結果は、約50%の完全長DNAが産生されることを示しています。
しかし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの占有が少なくなり、完全長DNAの割合が高くなることが観察されます。これは、レプリゾーンのより大きな集団が、停止したRNAPがない場合にRNAPの複製に正面から遭遇しないため、完全なDNAのみが得られ、DNAに結合した停止したRNAポリメラーゼ伸長複合体の存在下で複製と固相を実行する方法を示しました。この手順を行うときは、停止した転写複合体を高塩で洗浄して、DNAに非特異的に結合して複製を阻害する余分なRNAポリメラーゼを取り除くことが重要です。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この研究は、レプリソームが正面からRNAポリメラーゼ（RNAP）と遭遇した際の挙動を調査します。レプリソームは衝突時に停止しますが、Mfdによって促進されるプロセスを通じてRNAPをDNAから排除した後に伸長を再開することができます。
主要な研究要素
科学分野
- DNA複製
- 転写
- 酵素相互作用
背景
- レプリソームはDNA複製に不可欠です。
- RNAポリメラーゼ（RNAP）は転写に必須です。
- レプリソームとRNAPの衝突は複製を妨げる可能性があります。
- これらの相互作用を理解することは、細胞プロセスを解明するのに役立ちます。
研究の目的
- RNAPとの衝突後のレプリソームの運命を観察すること。
- Mfdが複製の再開にどのように影響するかを決定すること。
- 転写がDNA複製のダイナミクスに与える影響を分析すること。
使用された方法
- ビオチニル化DNA上の転写複合体の組み立て。
- 磁気ビーズ上でのRNAP伸長複合体の不動化。
- RNAP下流での複製フォークの形成。
- アルカリ性アガロースゲル電気泳動を用いたDNA産物の分析。
主要な結果
- レプリソームはRNAPとの衝突時に停止します。
- RNAPの排除後に複製が再開されます。
- 2.5 KBと3.6 KBの2つのDNA産物が観察されます。
- 結果はMfdが複製の再開を促進することを示しています。
結論
- レプリソームとRNAPの衝突は解決可能であること。
- Mfdが複製の再開を促進する上で重要な役割を果たすこと。
- これらのメカニズムを理解することは、DNA複製と転写への洞察を得るために不可欠であること。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding replication-transcription conflicts is critical for assessing genomic stability in preclinical models, as unresolved collisions can drive mutagenesis and impact target validation. The intrinsic stability of the replisome and its ability to resume synthesis after RNAP displacement provide a mechanistic basis for de-risking hypotheses about replication fidelity in disease-relevant systems. This work highlights how transcription-coupled repair factors like Mfd contribute to predictive confidence in DNA maintenance pathways, supporting early discovery decisions where genomic integrity influences target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about replication stress and genome maintenance pathways.
- Operational Value: Clarifies pathway context for targets involved in DNA repair or transcription regulation.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking Mfd activity to replication restart fidelity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Enables preparation of replication fork systems to test compound effects on transcription-replication conflicts.
- Quantitative Output: Generates defined DNA products (2.5 kb stalled, 3.6 kb full-length) for measurable readouts in biochemical screens.
- Reproducibility: Standardized immobilization and ligation steps support scalable assay formats for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to preclinical models where transcription-replication conflicts contribute to genomic instability.
- Translational Continuity: Bridges mechanistic insights from bacterial systems to eukaryotic contexts via conserved repair factors.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on targets where replication fidelity modulates therapeutic index or resistance mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions replication fork stability assessment between early hypothesis testing and lead optimization, particularly when evaluating compounds that modulate DNA transactions or chromatin dynamics.
- Discovery Biology: Tests how perturbations affect replisome persistence and RNAP displacement during head-on collisions.
- Screening: Produces quantifiable fork progression readouts to compare inhibitor or activator effects on restart efficiency.
- Analytics: Utilizes alkaline agarose gel resolution of radiolabeled DNA to measure stalled versus full-length products as a proxy for restart competence.
- Translational Research: Connects Mfd-dependent restart to human homologs (e.g., CSB) in preclinical validation of genome stability targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing replication-transcription interplay across multiple target classes and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by defining how replication forks withstand and recover from transcriptional obstacles.
- Operational Value: Delivers a standardized, bead-based system for reproducible fork assembly and collision analysis.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions on targets where replication stress sensitivity predicts phenotypic outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets by quantifying fork resilience under transcriptional load.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology, nucleic acid handling, and radiolabeled detection methods.
- Dependent on magnetic bead separation, ligation efficiency, and alkaline gel electrophoresis infrastructure.
- Needs standardization across laboratories for consistent RNAP immobilization and fork assembly.
- Adaptation to eukaryotic systems may require replisome reconstitution and chromatinized templates.
- Practical limitation: Assay duration and radioactivity use may constrain high-throughput deployment without automation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:16
Introduction
1:39
Preparation of the Halted RNAP Elongation Complex
3:07
Preparation of the Downstream Replicaton Fork
4:06
Assembly of the Replisome and Initiation of Leading Strand Synthesis at the Replication Fork
5:49
Representative Results for the Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase
6:49
Conclusion
