ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

本手順の全体的な目的は、正面衝突後のRepliゾーンおよびRNAポリメラーゼ（RNAP）の運命を観察することです。まず、ビオチン化DNA上に転写複合体を組み立て、それをStrippタブレットおよびビーズ上に固定化することで、RNAP伸長複合体を停止させます。次に、RNAP伸長複合体にフォーク状のDNAをライゲートし、正面衝突したRNAPの下流に複製フォークを形成させます。

手順の3番目のステップは、repli zoneを組み立て、複製フォークでリーディングストランドの合成を開始することです。手順の最終ステップは、磁気ビーズからDNAを分離し、PCR精製カラムでDNAを精製することです。最終的に、精製された放射標識DNA産物のアルカリアガロースゲル電気泳動を通じて、rosoが正面衝突型の転写複合体と衝突した際に停止することを示す結果を得ることができます。

こんにちは。ロックフェラー大学のマイク・オドネル研究室のリチャード・ポメランスです。本日は、固相におけるリボソームとRNAポリメラーゼの正面衝突を再現する手順を解説します。当研究室ではこの手法を用いて、DNA上の転写複合体が複製プロセスにどのような影響を与えるかを研究しています。

それでは、手順を開始します。まず、T7 A1プロモーターを含むビオチン化3.6 KB DNAテンプレートとRNAPホロ酵素を、100 µLのバッファーA中で混合し、37 °Cで10分間インキュベートします。10分間のインキュベート後、リボヌクレオチドのアデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、およびウリジン三リン酸を添加し、RNA合成を20ヌクレオチドに制限します。

停止したRN ap elongation complexをビーズ上に固定するため、溶液を37°Cでさらに10分間インキュベートします。この溶液をストレプトアビジンコート磁気ビーズに加えます。混合物を室温で10分間インキュベートしてください。

0.9 mLの高塩濃度バッファーでビーズを洗浄し、固定化された停止状態のRNAP伸長複合体を精製します。各洗浄後、非特異的なR-N-A-P-D-N-A複合体を除去するため、磁気分離によって上清を取り除きます。この洗浄操作を5回繰り返してください。

次に、ビーズを0.9 mLのバッファーAでさらに2回洗浄します。最終洗浄後、停止したRNAP伸長複合体に結合したビーズを100 µLのNew England Biolabsバッファー4に懸濁させ、ヘッドオン方向のRNAPの下流に複製フォークを構築して、下流の複製フォークを形成させます。次に、10 unitsのエビアルカリホスファターゼ（SAP）を加え、サンプルを37 °Cで10分間インキュベートします。ビーズを0.9 mLのバッファーAで3回洗浄します。その後、ビーズを50 µLのQuick T4リゲーション反応バッファーに再懸濁します。

2 µLのQuick T4リガーゼを加え、事前にフォーク形成させたDNAと共に、室温で10分間インキュベートします。最後に、0.9 mLのバッファーAでビーズをさらに3回洗浄します。停止したRNAP伸長複合体および下流の複製フォークが付着したマグネティックストレプトアビジンビーズに、ヘキサマーDNAヘリカーゼを混合します。150 µLのバッファーAで溶液を調製し、23 °Cで30秒間インキュベートします。

23°Cでの短い32回目のインキュベーション後、ポリメラーゼIII βクランプ、ATP、dGTP、dATP、α-P32標識dGTPおよびα-P32標識dATPを加え、全量を200 µLにします。サンプルを37°Cで5分間インキュベートします。

単鎖DNA結合タンパク質、DCTP、およびDTTPを添加して複製を開始します。また、$\alpha$ $^{32}\text{P}$標識DTTPおよびDCTPを加え、最終容量を250 $\mu\text{L}$にします。10分後、0.5 M EDTAを12 $\mu\text{L}$添加して反応を停止させます。

次に、strp din ビーズを沸騰させ、ビーズから DNA を遊離させます。プロテイナーゼ K を用いて 50 °C で 30 分間処理し、残留 DNA を除去します。再度ビーズを沸騰させ、磁気分離によって上清を除去します。

Kyogen PCR cleanup kitを用いて、DNAを含む回収した上清を精製します。最後に、精製した放射標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析します。RNAPと正面衝突した領域では、通常2.5 KBおよび3.6 KBの長さの2つの産物が生成されます。2.5 KBの産物は、フォークから停止したRNAPまでのDNAの長さを表しています。

これは、RNAPとの衝突により複製フォークが停止した結果です。3.6 KBの産物はフルレングスのDNAであり、RNAPによるプロモーターへの占有が不完全であるか、あるいは正面衝突したRNAPを複製フォークが部分的に読み飛ばした結果生じます。良好な結果では、フルレングスのDNAが約50%生成されます。

しかしながら、場合によってはプロモーターへのRNAPの占有率が低下し、フルレングスのDNAがより高い割合で観察されることがあります。これは、停止したRNAPが存在しないことで、より多くの複製開始領域においてRNAPとの正面衝突が起こらず、結果としてフルレングスのDNAのみが得られるためです。以上で、DNAに結合した停止状態のRNAポリメラーゼ伸長複合体が存在する場合における、複製および固相法の実施方法について説明しました。この手順を行う際は、DNAに非特異的に結合して複製を阻害する過剰なRNAポリメラーゼを除去するため、停止した転写複合体を高塩濃度で洗浄することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。