Name: 50パーセント溶血補体（CHの測定 50）活動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-29T18:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ血清中のCH50活性測定法。感作赤血球を用いた溶血反応で補体系の機能を評価し、免疫学的研究や免疫不全診断に有用なデータを提供します。

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著者は、映画撮影のためのテクニックと氏ポールシェパードを実行するためのミスローラマシューズに感謝したいと思います。このプロジェクトは、南オーストラリア大学、研究室医学のプログラムによって資金を供給された。

5倍のベロナール緩衝生理食塩水の調製（VBS） <ol><li>ベロナール緩衝生理食塩水（VBS）を準備するには、3つの別々のソリューションが用意する必要があります。 </li><li>蒸留水の350ミリリットルでナトリウムBarbitoneのNaClおよび0.94gmの21.25gmを溶解して溶液1を準備します。 NaClおよびナトリウムBarbitoneの最終濃度は、それぞれ1.02Mと13mmです。 </li><li>熱い蒸留水の125​​ミリリットルでBarbitoneの1.44gmを溶解して溶液2を準備します。 Barbitoneの最終濃度が62.5mMである。 </li><li>蒸留水の100mlにCaCl 2のMgCl 2と4.41gmの20.33gmを溶解して溶液3を準備。 MgCl 2とCaCl 2の最終濃度は2.18M、それぞれ440mMである。 </li><li>ミックスのソリューション1と2と室温まで冷却。 </li><li>組み合わせた溶液を冷却した後、溶液3の1.25ミリリットルを追加し、1M HClを用いて7.3から7.5にpHを調整する。 </li><li> 5倍のストック溶液を調製するために蒸留水で500ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 </li><li> 1Xワーキング溶液を調製するために、蒸留水で株式1:5に希釈する。 </li></ol>溶血素とヒツジ赤血球の感作性<ol><li>まず、VBSで1：50希釈して溶血を準備</li><li> VBSのSRBCを追加6ミリリットルの4ミリリットルに、穏やかに転倒混和</li><li> 600グラムX 5分間遠心</li><li>上清を捨て、細胞をさらに2回洗浄</li><li>最終洗浄後、細胞をパックに900グラムのx 5分で細胞を遠心分離</li><li>上清を破棄して、パックされた細胞の10％溶液、すなわち0.5ミリリットルを準備するのに十分なVBSで細胞を再懸は、緩衝液5 mlに再懸濁し、 </li><li>継続的に渦巻くながら、細胞への溶血素の等量（ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体）を追加滴下</li><li>水浴で30分間30℃でインキュベートする</li><li>静かに細胞ごとに15分を混ぜて</li><li> Sensitised SRBCは4℃で一晩保存することができます</li></ol> CH 50アッセイ<ol><li>午前1時08分、1:16、1:32、1:64と1:128との重複の管の一連のラベルを付けます。 </li><li>重複してVBSで制御し、試験血清の2倍連続希釈それぞれのシリーズを準備</li><li> 1:4（100ミリリットル血清+ 300ミリリットルVBS）で起動し、次のラベル付きチューブにサンプルの200ミリリットルを転送する。 </li><li>新鮮なピペットの先端で、次の希釈に希釈し、移転の200ミリリットルの間で充分に混合する。 </li><li>すべての5つの希釈が行われるまで繰り返します。 </li><li>最後の1:128希釈から200ミリリットルを捨てる。 </li><li>すべてのチューブに懸濁感SRBCの200ミリリットルを追加。 </li><li>ラベルつの異なるチューブは、BLANKと感作SRBC + 200ミリリットルVBSの200ミリリットルを追加します。これらのチューブは、VBSでSRBCの自発的な溶解を測定します。 </li><li> 総溶解などの別の2つの別々のチューブにラベルを付け、感作SRBC + 200ミリリットルの蒸留水200ミリリットルを追加します。 </li><li>静かにすべてのチューブを混ぜる。 </li><li> 37℃、15分後に混合水浴で30分間インキュベートします。 </li><li>堆積物に5分間赤血球、1,500 gで、サンプルを遠心分離します。 </li><li> 96ウェル平底プレートにウェルに各チューブから上清の100ミリリットルを転送する。 </li><li>各ウェルに蒸留水の100ミリリットルを追加。 </li><li>プレート分光光度計を用いて540nmでサンプルの吸光度を読み取る。 </li></ol>計算<ol><li>各サンプルについての平均吸光度を計算する</li><li>すべてのサンプルからブランク吸光度（自発的な溶解を）引く</li><li>次の式を使用して、各希釈用％の溶解を計算します。 <img src="/files/ftp_upload/1923/1923eq1.jpg" alt="方程式" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式"></li><li>横軸上に血清希釈に対する割合の溶解（縦軸）をプロットする。 </li><li>制御および試験血清の50％の溶血（図2）に必要な希釈を計算します。 </li></ol>代表的な結果： ビデオでは、代表的な結果の例が含まれています。実際には、コントロール血清はまた、テストの血清と同時に実行され、同じ方法で扱われます。以下の（表1）テストされた血清サンプルからサンプルデータです。データは5.3で示した方程式にしたがって操作されます。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> OD 540 </td><td> 意味 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>空</td><td> 0.042、0.044 </td><td> 0.043 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>総溶解</td><td> 0.183、0.183 </td><td> 0.183 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td> 希釈 </td><td> OD 540 </td><td> 意味 </td><td> 平均ブランク </td><td> ％の溶解 </td></tr><tr><td>午前1時08分</td><td> 0.200、0.219 </td><td> 0.210 </td><td> 0.168 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 1時16分</td><td> 0.179、0.173 </td><td> 0.176 </td><td> 0.134 </td><td> 93 </td></tr><tr><td> 1時32分</td><td> 0.134、0.110 </td><td> 0.122 </td><td> 0.08 </td><td> 55 </td></tr><tr><td> 1:64 </td><td> 0.053、0.066 </td><td> 0.059 </td><td> 0.017 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 1:128 </td><td> 0.044、0.045 </td><td> 0.045 </td><td> 0.003 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table><img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig1.jpg" alt="図1"> 図1。古典的補体経路の活性化。古典経路は、標的細胞の表面に結合免疫グロブリンM（IgM抗体）または免疫グロブリンG（IgG）をによって活性化される。抗体のFc部分がC1qに結合し、C1Rが活性化し、これは順番に一緒にC1sの2つの分子を活性化するC1Rの別の分子を活性化される。 C1sのは、今も切断されるC2の結合部位を公開してC4を切断する。 C4BとC2Aの結合は、C3転換と呼ばれる複合体の形成を導く。この複合体は今C3成形C3aとC3bを切断、C5の転換を形成するC3転換と組み合わせるそのうちのいくつか。この複合体は、現在の膜攻撃複合体（MAC）の形成を開始するC6への結合の結果C5bと、C5に作用する。で、最終的なMACの形成をもたらすC9で、最終的にはC8に行為をオンにしてC7でC5b6行為、。 （Goldsby ら 、2003）。 <img src="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1923/1923fig2.jpg" alt="図2"> 図2。サンプルデータをプロットし、制御と試験血清サンプルのCH50を計算する。（）、計算された割合（％）対照（•）と試験（両方の溶解は）血清サンプルを希釈率に対してプロットされています。それはグラフの線と交差して、縦線が希薄にダウン描画されるまで、（B）50％の溶解を計算するには、ラインは50％のパーセント値から描画されます。この例では、制御および試験血清の21.6倍に希釈、35倍希釈、50％の溶解を達成するために必要である。このデータは、50％の溶解に到達される前に以下の希釈、必要に応じて、コントロールに比べてテストの血清中に存在する以下の補数があることを示します。対照サンプルには、1:8の希釈で&gt; 100％の溶解を示しています。これは、多くの場合、補体成分を蒸留水とより効率的な溶解によりSRBCの不完全な溶解によるものです。

<ol><li>Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldsby%2C+RA+%22Immunology%22">Immunology</a>. , W.H. Freeman. (2003).</li>
</ol>

CH 50アッセイは、多くの干渉の対象となります。いくつかのSRBCでの活動を補完する関係がない自発的な溶血の結果、他のものより壊れやすいものです。ウサギの抗体の親和性はロットし、1つのメーカーによって異なりますが、これはSRBCに結合する抗体の量に影響を与えます。また、抗体のコーティングの異なる量のSRBCによる細胞内で抗体の結果とSRBC感作のプロセス。検体採取と保管は、エラーの重要な潜在的なソースです。補体成分などC1q、C3、C4とC5は非常に不安定であるため、適切なサンプルの処理が非常に重要です。熱に長時間さらされるには、補体活性を減少し、補体成分の不活性なフラグメントを生成します。可能な限りエラーの多くの源として検出するために、それは知られているCH 50値で検定が行われ、既知の血清対照の使用可能な値を再現するたびに、コントロール血清をテストすることが重要です。 SRBCと溶血の異なるバッチ間の違いがあるかどうかを判断する一つの方法は、血清中に数回の標準サンプルに対して新しいテストの材料をテストし、溶血の基礎レベルでまたはCH 50値の変更があるかどうかを判...

<table><tbody><tr><td>羊赤血球</td><td>CSL</td><td>2490201</td><td>最終濃度 1% で使用</td></tr><tr><td>血清</td><td></td><td></td><td>ヒト血清</td></tr><tr><td>ウサギ抗羊溶血血清 (RBCs)、非標識</td><td>AbD Serotec</td><td>C12HSB</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>ベロナール緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>最終濃度 1x で使用</td></tr><tr><td>恒温水槽</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 室/インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

50パーセント溶血補体（chの測定 50</sub血清中>）活動

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

補体系は、細胞溶解をターゲットにつながる活性化とopsonisationを通して食作用を促進するタンパク質のグループです。個々の補体成分は、しかし、これは経路の活性などの情報を提供しない定量することができる。 CH<sub&gt; 50</sub&gt;古典的補体経路（図1）の活性化のためのスクリーニングアッセイであり、経路の任意のコンポーネントの削減、不在および/または非アクティブに敏感です。 CH<sub&gt; 50</sub&gt;ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（溶血素）をプレコートヒツジ赤血球（SRBC）を溶解するために古典経路の血清補体成分の機能的能力をテストします。抗体でコーティングされたSRBCは試験血清、補体古典経路が活性化され、溶血の結果とインキュベートされている場合。補体成分が存在しない場合、CH<sub&gt; 50</sub&gt;レベルはゼロになります。古典経路の1つまたは複数のコンポーネントが減少している場合は、CH<sub&gt; 50</sub&gt;縮小されます。最適に感作されたSRBCの固定量は、各血清希釈に追加されます。インキュベーション後、混合物を遠心分離し、溶血の程度は540nmで上清中に放出されたヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量される。補体活性の量は、抗体コーティングされたSRBCを溶解するために血清検査の種々の希釈物の容量を調べることによって決定されます。このビデオでは、古典的補体経路の補体活性のレベルを分析に関わる実験的な手順を説明します。

古典経路は、抗体によって活性化し、標的細胞の溶解で最高潮に達しますれる。 CH<sub&gt; 50</sub&gt;アッセイは、血清サンプルの補体活性の尺度を提供する。このビデオでは、CHを決定する際に必要な手順を示しています<sub&gt; 50</sub&gt;血清サンプルの、結果の計算と解釈する。

50パーセント溶血補体（CHの測定 50</sub血清中>）活動

補完系は、活性化されると標的細胞の溶解を誘導し、オプソニン化を通じて食細胞作用を促進するタンパク質群である。個々の...

血清の50%溶血補体活性（CH50）を測定します。氷上で保存した検査血清を200 µLおよび1000 µL分注可能なピペット、感作済み羊赤血球、バロン緩衝生理食塩水、蒸留水、検査血清用チューブ、およびベースラインと完全溶血用チューブが必要です。また、ボルテックスミキサーと、ラベルを貼付した96ウェル平底プレートを用意してください。チューブには個別にコントロールと最終希釈倍率を記載します。本例では、1/8希釈から開始します。2倍希釈を繰り返し、1/16、1/32、1/64、1/128希釈液を作成し、残りのチューブに「blank」および「total lysis」とラベルを貼ります。すべてのチューブにラベルを貼ったら、検体血清の希釈を開始します。まず、新しいチューブにR buffer salineを300 µL分取します。次に、100 µLの血清を300 µLのRバッファー生理食塩水に分注します。これにより、4倍の初期希釈液が得られます。血清サンプルを十分に混合してください。次に、あらかじめラベルを貼っておいたチューブに200 µLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を分注します。また、全溶解チューブとして使用する2本のブランクチューブにも200 µLのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。ただし、ブランクチューブにはリン酸緩衝生理食塩水ではなく、200 µLの蒸留水を加えてください。次に、4倍希釈した血清を200 µL取り、1/8と表記されたチューブに移します。あらかじめ、1/8から1/128までの連続したチューブに、PBSを200 µLずつ分注してあります。これにより、1/8希釈液が作成されます。サンプルを十分に混合した後、200 µLを16でラベル付けされた1番目のチューブに移します。すべてのチューブの希釈が完了するまでこの操作を繰り返します。最終的な液量が200 µLになるよう、1/28希釈のチューブから200 µLを廃棄します。感作させた羊赤血球は、時間の経過とともに沈殿している場合があります。チューブを数回そっと転倒混和させ、再懸濁させる必要があります。十分に再懸濁させた後、感作させた羊赤血球 200 µL を、準備した各チューブに分注してください。血清が赤血球と十分に混ざり合っていることを確認します。ブランクチューブに感作羊赤血球を加えることで自発的溶血率を決定でき、完全溶血チューブに血液を加えることで100%の値を決定できます。ボルテックスミキサーを低速に設定し、各チューブを穏やかに混合します。その後、チューブを37 °Cの恒温水槽に入れ、30分間インキュベートします。15分間のインキュベーション後、チューブを再度軽くボルテックスし、さらに15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを4°Cに設定した遠心機に移し、1500 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを慎重に取り出し、適切なホルダーに配置します。ここで、赤血球のペレットが確認でき、SNAは赤色に見えます。ヘモグロビン転移を行うため、96ウェル平底プレートの必要な数のウェルに、蒸留水を100 µLずつ分注します。ペレットを転移させないよう注意しながら、上清を100 µLずつ96ウェルプレートの適切なウェルに転移します。すべてのサンプルをプレートにロードした後、540 nmに設定したプレート分光光度計を用いて吸光度を測定します。ここでは、2つの反復試料（A1およびB1）の未処理の吸光度データを示します。1/8希釈のデータをご参照ください。次に、16倍、32倍、64倍、および128倍希釈のデータがあります。A6およびB6はブランクです。一方、A7およびB7は全溶解サンプルです。データの収集が完了したら、各デュプリケートサンプルの平均吸光度を算出します。次に、自発的溶血に相当するブランクの吸光度をすべてのサンプルから差し引きます。すべてのデータが揃ったら、以下の計算式を用いて各希釈段階の溶血率を算出してください。すべてのデータの計算が完了したら、縦軸に溶血率を、横軸に血清希釈倍率をプロットします。得られたグラフを用いて、感作した羊血球の50%を溶血させるのに必要な血清希釈倍率を算出できます。このグラフは、血清の希釈倍率に対する溶血率のプロットを示しています。次に、50%溶血点から曲線と交差するまで線を引きます。曲線と交差した点から、水平軸に向かって垂直に線を下ろします。この値は、50%溶血を確実にするために血清を希釈すべき希釈倍率を表します。2つの血清サンプルを比較してCH 50に差があるかどうかを判断する場合、50%溶血をもたらすこの希釈倍率を指標として使用できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

効果的に浄化がしばしば必要とされる免疫細胞集団の機能を研究する。補体の枯渇は、高純度と免疫細胞集団を単離するための高速かつ安価な手法です。...

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高分子血液導管への血液曝露は、臨床合併症に関与している異物反応を開始します。ここでは、これらの導管を介した血液灌流を模倣する実験ツールであるチャンドラーループ装置について説明します。組換えCD47の付属物は、これらの導管での異物反応の証拠を減少させます。...

の使用生体外チャンドラーループ装置は、改質ポリマー血液導管の生体適合性を評価するための

ここでは、気管支肺胞洗浄剤や血清などの生体液中のキチナーゼ活性を測定する簡単な方法を示す。...

生体試料中のキチナセ活性の測定

このプロトコルは、レーザーカット神経血管インプラントを用いた血液接触装置の包括的な血溶性評価について説明する。新鮮なヘパリン化されたヒト血液を有するフローループモデルは、血流を模倣するために適用される。灌流後、種々の血液学的マーカーを分析し、試験された装置の血相適合性評価のために採血後に直接得られた値と比較する。...

ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。...

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

学ぶ血清中のCH50活性測定法。感作赤血球を用いた溶血反応で補体系の機能を評価し、免疫学的研究や免疫不全診断に有用なデータを提供します。

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