50パーセント溶血補体（CHの測定 _50）活動

血清の50%溶血補体活性（CH50）を測定します。氷上で保存した検査血清を200 µLおよび1000 µL分注可能なピペット、感作済み羊赤血球、バロン緩衝生理食塩水、蒸留水、検査血清用チューブ、およびベースラインと完全溶血用チューブが必要です。また、ボルテックスミキサーと、ラベルを貼付した96ウェル平底プレートを用意してください。チューブには個別にコントロールと最終希釈倍率を記載します。本例では、1/8希釈から開始します。

2倍希釈を繰り返し、1/16、1/32、1/64、1/128希釈液を作成し、残りのチューブに「blank」および「total lysis」とラベルを貼ります。すべてのチューブにラベルを貼ったら、検体血清の希釈を開始します。まず、新しいチューブにR buffer salineを300 µL分取します。

次に、100 µLの血清を300 µLのRバッファー生理食塩水に分注します。これにより、4倍の初期希釈液が得られます。血清サンプルを十分に混合してください。

次に、あらかじめラベルを貼っておいたチューブに200 µLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を分注します。また、全溶解チューブとして使用する2本のブランクチューブにも200 µLのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。ただし、ブランクチューブにはリン酸緩衝生理食塩水ではなく、200 µLの蒸留水を加えてください。

次に、4倍希釈した血清を200 µL取り、1/8と表記されたチューブに移します。あらかじめ、1/8から1/128までの連続したチューブに、PBSを200 µLずつ分注してあります。これにより、1/8希釈液が作成されます。

サンプルを十分に混合した後、200 µLを16でラベル付けされた1番目のチューブに移します。すべてのチューブの希釈が完了するまでこの操作を繰り返します。最終的な液量が200 µLになるよう、1/28希釈のチューブから200 µLを廃棄します。

感作させた羊赤血球は、時間の経過とともに沈殿している場合があります。チューブを数回そっと転倒混和させ、再懸濁させる必要があります。十分に再懸濁させた後、感作させた羊赤血球 200 µL を、準備した各チューブに分注してください。

血清が赤血球と十分に混ざり合っていることを確認します。ブランクチューブに感作羊赤血球を加えることで自発的溶血率を決定でき、完全溶血チューブに血液を加えることで100%の値を決定できます。ボルテックスミキサーを低速に設定し、各チューブを穏やかに混合します。その後、チューブを37 °Cの恒温水槽に入れ、30分間インキュベートします。

15分間のインキュベーション後、チューブを再度軽くボルテックスし、さらに15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを4°Cに設定した遠心機に移し、1500 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを慎重に取り出し、適切なホルダーに配置します。ここで、赤血球のペレットが確認でき、SNAは赤色に見えます。

ヘモグロビン転移を行うため、96ウェル平底プレートの必要な数のウェルに、蒸留水を100 µLずつ分注します。ペレットを転移させないよう注意しながら、上清を100 µLずつ96ウェルプレートの適切なウェルに転移します。すべてのサンプルをプレートにロードした後、540 nmに設定したプレート分光光度計を用いて吸光度を測定します。

ここでは、2つの反復試料（A1およびB1）の未処理の吸光度データを示します。1/8希釈のデータをご参照ください。

次に、16倍、32倍、64倍、および128倍希釈のデータがあります。A6およびB6はブランクです。一方、A7およびB7は全溶解サンプルです。

データの収集が完了したら、各デュプリケートサンプルの平均吸光度を算出します。次に、自発的溶血に相当するブランクの吸光度をすべてのサンプルから差し引きます。すべてのデータが揃ったら、以下の計算式を用いて各希釈段階の溶血率を算出してください。

すべてのデータの計算が完了したら、縦軸に溶血率を、横軸に血清希釈倍率をプロットします。得られたグラフを用いて、感作した羊血球の50%を溶血させるのに必要な血清希釈倍率を算出できます。このグラフは、血清の希釈倍率に対する溶血率のプロットを示しています。

次に、50%溶血点から曲線と交差するまで線を引きます。曲線と交差した点から、水平軸に向かって垂直に線を下ろします。この値は、50%溶血を確実にするために血清を希釈すべき希釈倍率を表します。2つの血清サンプルを比較してCH 50に差があるかどうかを判断する場合、50%溶血をもたらすこの希釈倍率を指標として使用できます。