Name: でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングでシロイヌナズナの組織特異的フィトクロム応答を調査する方法。この技術は植物の光応答メカニズム解明に有用です。

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植物のフィトクロム反応にモンゴメリーラボでの作業は、国立科学財団（助成金BLMにない。MCB - 0919100）と化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学局、科学局、米国エネルギー省によってサポートされていますエネルギー（BLMへの助成金がない。DE FG02 91ER20021）。我々は共焦点の支援のためのシロイヌナズナプロトプラストの選別と博士メリンダフレームのプロトコルをソート蛍光活性化細胞の開発と最適化を支援するため博士はルイ王、実験的な援助のために、ステファニーコスティガンを撮影中に技術支援のためにメリッサウィテカーを感謝し、批判的に原稿を読んで顕微鏡。我々は編集支援のためのグラフィカルな設計の支援とカレンの鳥のためにマレーネキャメロンに感謝。

1。植物の成長<ol><li> 4（概要は図1参照）と野生型または親の行を説明するように単離した確認UAS - BVR X GAL4 - GFPエンハンサートラップライン、すなわちラインごと〜2000滅菌種子を、土壌に播種されています。 </li><li>植物は、22で100μmolm-2 s -1の白色照明° Cと70％の湿度下での土壌で5週間栽培されている。 </li></ol> 2。葉プロトプラスト単離（Deneckeとヴィタール9から適応） <ol><li>プロトプラストを単離するために、TEXのバッファを用意する。 - （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES、2.56 mM）で、0.75 gの塩化カルシウム二水和物（塩化カルシウム2 · 2H 2 O、6.75 3.1グラムGamborgのB5塩、0.5 G 2：1リットルTEXのバッファの場合は、次のコンポーネントを重量を量るmM）を、0.25 gの硝酸アンモニウム（NH 4 NO 3、3.12 mM）で、136.9グラムのショ糖（0.4M）が。脱イオン、蒸留水の〜900ミリリットル（のddH 2 O）でコンポーネントを完全に溶解し、1で5.7にpHをもたらすM KOH。 1リットル、真空ポンプに接続さ0.2μmのボトルトップフィルターと殺菌フィルターに最終的なボリュームをもたらす。 </li><li>植物から緑、健康な葉を（緩くビーカーに充填葉の〜250 ml）を収集し、〜40ミリリットルのddH 2 O 4回で洗い流し、滅菌のddH 2 Oで二回リンスが続く細い短冊状に＃20メス、カット葉を使用し、均等に2個の50 mlの滅菌プラスチックチューブに組織を分割する。 10倍の葉の消化のストック溶液を5mlのアリコートを追加することにより、1 ×葉の消化液を調製する（10倍の葉の消化のストック溶液：2％（w / v）のMacerozyme R - 10、4％（w / v）のセルラーゼ"小野塚"TEXバッファでR - 10を、溶解0.2μmのフィルターで滅菌し、45 mlの新鮮なTEXのバッファは-80で5 mlのアリコート° C）を凍結フィルタ。すべての葉組織をカバーし、50 mlチューブあたり1 ×葉の消化ミックスの〜25 mlを加え。 </li><li>穏やかに振盪しながらロッカーに室温で3時間のインキュベーションに続いて水ポンプに接続された真空デシケーターを用いて室温で1時間開いてチューブ内の消化液中の葉組織を浸潤する掃除機。 1X葉の消化ミックスの葉組織を持つキャップチューブは、光への暴露を防止するためにこのプロセスの間にアルミホイルに包んで保存されています。 </li><li> 3時間後、プロトプラストを解放するために〜2分間ロッカーの速度を増加させる。残渣を除去し、無菌のガラスビーカーにろ液を収集するために滅菌チーズクロスの二つの層を通して原油プロトプラスト懸濁液をフィルターします。滅菌シャーレに無菌100μmのナイロンメッシュを通してろ液をフィルタします。フロースルーを収集し、新しい滅菌50 mlチューブに移す。滅菌シャーレを洗浄し、表面に付着したプロトプラストを収集するために新鮮なTEXのバッファの15〜20 ml程度使用してください。 </li><li> 10で100xgでスイングバケットローターを使用して℃で15分（加速度6、減速0）のためにフロースルーを心する。 </li><li>無菌9"ガラスパスツールピペットは、フローティングプロトプラストの層を乱さないと〜10を離れることなく、蠕動ポンプに接続した状態で、残留してペレット破片が含まれているフローティングプロトプラストの層、下に液体を30ml - - 15mlの体積〜25を削除します。 </li><li>優しくプロトプラストを懸濁させる一方40mlの最終容量に新鮮なTEXのバッファを追加。 </li><li>できる限り多くの細胞残渣を除去するステップを2.5から2.7を2回繰り返します。遠心時間は、最初の繰り返しで10分に及び、最終的な繰り返しで5分に短縮されます。 </li><li>カット、新しい15mlのチューブに滅菌1 mlの転送ピペットでフローティングプロトプラストを吸引除去する。 4℃で2時間ソートするまでCまでのソートまたは暗所で店舗に直接進む。 </li></ol> 3。蛍光活性化細胞選別（FACS）によるソ​​ートプロトプラスト<ol><li>ソートする前に、プロトプラストの整合性とプロトプラストのプール内のGFP蛍光の有無を確認するために励起用の488 nmのレーザーを使用して共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）でプロトプラストを調べます。最小限の残骸は、FACSソーティングノズルを目詰まりを避けるために必要です。 </li><li>適応プロトコル10を以下の約9 psiのシステム圧力で、6,000と15,000の間でイベントのレートでマクロソートの頭の上に200μmのノズルを用いてFACS経由TEXバッファー（BD FACSVantage SE、BD Biosciences社）でソート孤立プロトプラスト。 </li><li>野生型非GFPのプロトプラストは、自家蛍光のしきい値を決定するために使用されます。 </li><li> GFP陽性プロトプラスト、30分の530バンドを使用してGFP蛍光を識別するために、488 nmのアルゴンラインでの空冷アルゴンレーザー（スペクトラフィジックスモデル177、ニューポート社、カリフォルニア州アーバイン）は100 mWで動作を使用してソートの細胞を収集するにはフィルタを通過する。 </li><li> GFP陽性のプロトプラストのコレクションに続いて、ステップ3.1で説明するようにCLSMでソートプロトプラストを調べます。 </li><li>キアゲンしたRNeasy植物ミニキットを使用してソートされたプロトプラストからトータルRNAを抽出する。アフィメトリクスGeneChip exprに説明されているようにcDNAをハイブリダイゼーション用に調製することができるession解析技術マニュアル、その後ATH1シロイヌナズナアフィメトリクスの全ゲノム配列にハイブリダイズした。 </li></ol>代表的な結果我々は、FACSによるGFPのチャネルでGFP陽性細胞（図2）のかなりの数を検出する。血管や皮膚の発現に伴い、J1071は、〜1.4％のGFP陽性プロトプラストを持っていたのに対し、GFPエンハンサートラップの両親、構成的にGFPを発現するライン、J0571、表示された〜17％〜24パーセントのGFP陽性プロトプラストを用いた最適化アッセイで（表1）。 1時間J0571プロトプラストの3 ×500μlの（プロトプラスト懸濁液の約1.5 mlの合計）のソートは〜100,000 GFP陽性プロトプラストを与えた。 1.5時間J1071プロトプラストの3 × 500μlの（〜1.5ミリリットルの合計プロトプラスト懸濁液）のソートは、約3,000 GFP陽性プロトプラストを与えた。ソートが（図3Cと3E）に実施される前に、共焦点画像はJ0571とJ1071の両方のサンプルのプロトプラストの非常に高い収率を示し、ソートされたフラクションは、唯一の明るいGFP蛍光プロトプラストを（図3Gと示されていないデータ）が含まれていました。この発見は、無傷のGFP陽性プロトプラストを確認FACSを経由して並べ替えることができます。非GFPのプロトプラストはまたソートし、別々のチャンネルに集めることができます。非GFPのプロトプラストはholophytochromeレベルの減少によって遺伝子発現の特定の変更を検出するために、その後のマイクロアレイ解析のための理想的なネガティブコントロールとして機能する。分離されたプロトプラストからのRNA抽出（1 ml）をfluorospectrometry（図4）による検出のための十分な量のRNAが得られます。単離されたRNAは、光度計計器（光度計1000、サーモサイエンティフィック）を用いて評価し、光度計3.7.1 RNAの定量のソフトウェアにより定量した。 RNAの収量は、C24野生型プロトプラストまたは事前ソートされたFACSをソートから、GFP陽性のエンハンサートラップのプロトプラストは、マイクロアレイ用のRNAラベリングアッセイ（表2）で使用するために必要な最小20 ngを超えました。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>エンハンサートラップライン</td><td> GFP陽性のプロトプラストの％ </td><td>ソートされたGFPのプロトプラストの数</td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17.18パーセント〜24.06パーセント</td><td> 26400〜36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 〜1.43パーセント</td><td> 1,000〜1300 </td></tr></tbody></table>ソートおよび蛍光活性化細胞ソーター（FACSVantage、BD）を介してプロトプラスト懸濁液500μLを実行することにより、収集したGFP陽性プロトプラストの数の前に2エンハンサートラップ系統のGFP陽性プロトプラストの表1。割合。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>工場のライン</td><td> RNA収量（NG） </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> 表2。プロトプラストからのRNA分離からの収量。 RNAは、2つのエンハンサートラップラインから事前にソートされたC24野生型またはソートされたGFP陽性のプロトプラストから分離し、定量した。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 ビリベルジン還元酵素（BVR）トランスジェニックシロイヌナズナ植物における発現のGAL4エンハンサートラップベースの誘導。 （A）。 GAL4応答性GFPマーカー遺伝子を含むGAL4ベースエンハンサートラップ系統、、のライブラリーから選択された個々のマークGAL4含有細胞で標的遺伝子の発現を誘導するGAL4応答性標的遺伝子を含む系統と交配することができますGFP蛍光による。博士ジムHaseloff（http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html）から図に基づいて。親系統におけるフィトクロム発色団、phytochromobilin（PΦB）とholophytochromeの（B）生産。 （C）左、ビリベルジン還元酵素（BVR）BRとPΦRに活動してビリベルジンIXα（BVIXα）とPΦBの削減、それぞれ。 PΦBの枯渇でBVRの活動の結果と光の生産holophytochromeの低下を導く。右、BVRによって触媒される反応が示されています。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。蛍光活性化細胞選別（FACS）取得のドットプロット。 C24野生型（）、J0571（B）およびJ1071（C）のソートプロトプラストの細胞の比較。 （A）非GFP蛍光C24野生型プロトプラストの取得ドットプロットでは、488 nmのアルゴンレーザーで励起し、自家蛍光閾値を決定するために使用。 （B）と（C）取得のドットプロットは、488 nmレーザーで励起に応答してGFP陽性であるプロトプラストの比率を示す。 R3は、BとC区切るのゲート蛍光活性化セルソーター（FACSVantage、BD）でソートし、収集されたGFP陽性のターゲットを選別。赤のチャネルには、vを示していますプロトプラストと緑のチャンネルからのクロロフィルの自家蛍光用alues​​は、GFP蛍光の値を示します。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。細胞選別のために使用される植物プロトプラストの共焦点顕微鏡。共焦点レーザーは、蛍光活性化セルソーター（FACS）を経由して（G）ソートする前に（A、C、E）と後のプロトプラストの画像をスキャン。 B、​​D、F及びHは、DICイメージです。 C24野生型（A、B）、J1071（C、D）およびJ0571（E、F、G、H）のプロトプラストが表示されます。 488 nmレーザーで励起から得られると自家蛍光（LP 650 nmの） - 画像C、EおよびGは、GFP蛍光（575 nmのBP 505 nm）の画像をマージされます。 Hを介して63x油下4スキャンの平均です。バー= 10μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。fluorospectrometryによってプロトプラストから単離されたRNAの定量。 RNAは、（）C24野生型、（B）J0571、および（C）J1071から抽出。事前にソートされた野生型プロトプラストのためのRNAを示している。 BとCは、蛍光活性化細胞選別（FACS）でソートGFP陽性プロトプラストからRNAを示している。 RNAの定量のソフトウェア、光度計3.7.1、（エルエムエス1000、サーモサイエンティフィック）。

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</ol>

マイクロアレイ（1）を介して遺伝子発現プロファイリングは、11規制シロイヌナズナ実生の遺伝子の30％以上が光であることが分かっていますし、（2）、13フィトクロムシグナル伝達カスケード12に関与する光シグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の広大なグループを特定している。そのような実験は、光が遺伝子発現の急激かつ長期的変化を誘導することを示唆している。フィトクロムの各プールには、発達と適応応答のサブセットのみを制御してもよい。また、下流のシグナル伝達成分が細胞と組織特異的様式2、14、15のフィトクロムと相互作用する可能性があります。 下流候補遺伝子の発現は、アップまたは標的BVRの発現の際にダウンレギュレートすることができます。 UAS - BVR X GAL4 - GFPの子孫と親系統における遺伝子発現の変化の比較分析を通じ、我々は遺伝子発現に明らかな変化を識別することができますどこにローカライズされたフィトクロム欠陥からそのような変更の結果。遺伝子発現プロファイルに基づい...

<table><tbody><tr><td>抗BVR抗体</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ &amp;#8220;小野塚&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA 電気泳動</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>ガンボーグ&amp;rsquo;B5 basal salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>マセロザイム R-10</td><td>SERVA 電気泳動</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES、低水分含有量</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲ・スクーグ塩</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>フィタブレンド</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant Minikit</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

でfacsアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

光を媒介する植物のライフサイクルを通じての発達と適応のプロセスの配列。植物は光受容体が感知し、光に適応するために呼ばれる光吸収分子を利用する。赤色/遠赤色光吸収フィトクロム光受容体が広く研究されている。フィトクロムは、彼らが研究されている、すべての高等植物のシステムで異なると重複する機能を持つ蛋白質の家族として存在<sup&gt; 1</sup&gt;。種子の発芽から開花と老化の範囲フィトクロムを介した光反応は、しばしば特定の植物組織または器官に局在している<sup&gt; 2</sup&gt;。変異の分析を通じて、個々と冗長なフィトクロム機能の発見と解明にもかかわらず、photoperceptionと空間固有のフィトクロム応答を仲介するフィトクロムのローカライズされたプールの分子メカニズムの異なるサイトでの決定的な報告は限られている。我々は、フィトクロムphotoperceptionの特定の部位は組織や光形態形成の臓器特異的な側面、およびそのローカライズされたフィトクロムプールは細胞間のシグナル伝達の下流の標的遺伝子の異なるサブセットを従事を調節することが仮説に基づいて実験を設計した。我々は、選択的臓器、またはトランスジェニック植物内で組織特異的に機能的なフィトクロムを減らすために生化学的アプローチを開発した。我々の研究は、転写活性化因子GAL4による上流活性化配列（UAS）の要素の制御下にある遺伝子の発現のトランスをもたらすことが二部エンハンサートラップのアプローチに基づいています<sup&gt; 3</sup&gt;。ビリベルジン還元酵素（<em&gt; BVR</em&gt; UASの制御下にある）遺伝子は、黙ってUAS - BVRの親のGAL4トランス活性化のない状態で維持されている<sup&gt; 4</sup&gt;。 UAS - BVRトランスジェニックラインとの特異的発現のGAL4 - GFPエンハンサートラップラインの結果との間の遺伝的交雑<em&gt; BVR</emによってマークされた細胞の&gt;遺伝子<em&gt; GFP</em&gt;表現<sup&gt; 4</sup&gt;。フィトクロム発色団欠乏症におけるシロイヌナズナの結果でBVRの蓄積<em&gt;植物体の</em<sup&gt; 5月7日</sup&gt;。従って、我々が生産されていることをトランスジェニック植物は、GAL4 -依存性の活性化を示す<em&gt; BVR</em&gt;フィトクロムの生化学的不活性化で得られた遺伝子だけでなく、GAL4依存<em&gt; GFP</em&gt;表現。の光生物学と分子遺伝学的解析<em&gt; BVR</em&gt;トランスジェニックラインでは、組織とphotoperceptionの対応する部位に関連付けられている臓器特異的なフィトクロムを介する応答への洞察を生み出している<sup&gt; 4、7、8</sup&gt;。 GFP陽性の蛍光活性化細胞選別（FACS）、エンハンサートラップによって誘導される<em&gt; BVR</emマイクロアレイ解析を通じて、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングと相まって&gt;発現植物プロトプラストは、空間的な固有のフィトクロム反応を媒介に関与推定下流の標的遺伝子を同定するために使用されています。この研究は、様々な組織や器官が光によって調節された植物の成長と発展に協力するメカニズム、光覚の部位の我々の理解を拡大し、複雑なフィトクロムを介した細胞間のシグナル伝達カスケードの分子解剖を進めています。

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

光は、植物のライフサイクルを通じて、一連の発達および適応プロセスを媒介します。植物は、...と呼ばれる光吸収分子を利用して、

特定の植物細胞型におけるフィトクロム応答を検討するため、GAL 4G FPエンハンサートラップ株とU-A-S-B-V-Rトランスジェニック株を交配させ、フィトクロム欠損株を作製した。U-A-S-B-V-RとGA 4G FPの交配から得られた子孫植物から葉プロトプラストを単離した。次に、GFP陰性とGFP陽性のプロトプラストを別々のサンプルとして分離するため、FACSを用いてプロトプラストの分取を行います。分離したプロトプラストは共焦点レーザー走査顕微鏡で解析します。GFP陽性プロトプラストの回収を確認するため、プロトプラストからRNAを抽出し、スペクトル解析を行います。こんにちは、ミシガン州立大学エネルギー植物研究室のBARDA Montgomery研究室のSanka Pivarです。本日は、蛍光活性化細胞分取（FACS）および細胞型特異的な遺伝子発現解析のために、Arabidopsis thalianaから葉プロトプラストを単離する手順をご紹介します。当研究室では、組織および器官特異的なフィトクロム依存的応答を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。本手順で使用したArabidopsis ANA系統は、二分法的なエンハンサートラップ法を用いて作製されました。親系統の一つは、galの発現パターンが異なるエンハンサートラップ系統のライブラリーから得られたものです。また、もう一方の親系統は、上流活性化配列（UAS）の制御下でGFPを発現しています。簡潔に述べると、転写因子GAL4はUASの制御下にあるあらゆる遺伝子を活性化します。親系統1では、GAL4がGFPを活性化します。親系統1を親系統2と交配させました。親系統2では、BVR遺伝子がUASを介してGAL4の制御下にあります。交配によって得られた系統はU-A-S-B-V-R cross G 4G FPである。親系統では、フィトクロム色素体の生合成は、hemeを経てLAからbiver（略称bv）へと進行する。しかし、後代ではBVR遺伝子産物がBV前駆体を還元することにより、フィトクロム色素体の生合成を阻害する。このエンハンサートラップBVR後代系統は確認済みであり、活性フィトクロムレベルの低下が異なる植物組織にどのように影響するかを調べるために使用できる。葉のプロトプラストを調製するために、植物の育成用土およびポットを準備することからこの手順を開始します。1回の実験につき1サンプルあたり約2000粒の滅菌済み種子を、ポット内の土壌に播種します。ポットを入れたトレーの底に水を加え、トレー全体をプラスチックラップで覆います。白光照射下、22 °C、湿度70%の条件で植物を5週間育成します。最初の5〜6日後、種子の発芽を確認し、トレイからラップを取り除きます。プロトプラストを単離するために、まずTEXバッファーを調製します。バッファー1 L分として、GA's B 5 salts（MES、塩化カルシウム、硝酸アンモニウム、スクロース）を計量します。約900 mLの脱イオン蒸留水（DD H2Oと略記）に成分を完全に溶解させます。1 M KOHを用いてpHを5.7に調整します。その後、最終容量を1 Lとし、フィルター滅菌を行います。次に、植物から健康的で緑色の葉を採取します。ビーカーに葉を軽く詰め、約250 milliliters分を採取します。葉を40 millilitersで洗浄します。20番のメスを用い、滅菌したDD H2Oで4回洗浄した後、さらに2回すすぎます。葉を細い帯状に切り、組織を2本の50 mL滅菌プラスチックチューブに等分して分注します。1x葉消化ミックスは、TEXバッファーに2% (w/v) のMazy R10および4% (w/v) のCellulase (on Azua R10) を溶解して調製した10xストック溶液の5 mL分注量を、45 mLの新鮮なTEXバッファーに加えることで調製します。1×葉消化液を約25 milliliters加えます。各チューブ内の葉の断片に混ぜ合わせ、すべての葉組織が浸るようにします。真空浸透処理を行い、葉組織に消化液を浸透させます。ウォーターポンプに接続した真空デシケーターを用い、開いたチューブの中で室温で1時間混合します。葉組織と葉消化ミックスを含むキャップチューブは、光への露出を防ぐためにアルミホイルで包んでください。続いて、ロッカーを用いて室温で3時間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。3時間後、ロッカーの速度を2分間上げてプロトプラストを遊離させます。粗製プロトプラスト懸濁液を2層の滅菌チーズクロスでろ過してデブリを除去し、ろ液を滅菌ガラスビーカーに回収します。さらに、ろ液を滅菌済みの100 µmナイロンメッシュでろ過し、滅菌シャーレに回収します。フロースルーを回収し、新しい滅菌済みの50 mLチューブに移します。約15 mLの新鮮なTEXバッファーを用いて滅菌済みのシャーレを洗浄し、表面に付着しているプロトプラストを回収します。フロースルーを、加速6、減速0に設定したスイングバケット型遠心機を用い、10 °Cで100 ×gにて15分間遠心分離します。ペリスタルティックポンプに接続した滅菌済みの9インチガラス製パステールピペットを使用し、浮遊プロトプラスト層を乱さないように注意しながら、残渣やペレット状のデブリを含む浮遊プロトプラスト層下の液量を、10から50 mL残るまで、約25から30 mL除去します。ペレット状のデブリを除去した後、新鮮なTEXバッファーを加えて最終容量を40 mLにします。プロトプラストを穏やかに再懸濁させながら、デブリの除去と残った浮遊プロトプラストの再懸濁を繰り返します。細胞デブリを可能な限り除去するため、さらに2回繰り返します。遠心分離の時間は、1回目の繰り返しでは10分に、最後の繰り返しでは5分に短縮します。最後に、滅菌済みの1 mL転送ピペットを使用して、浮遊しているプロトプラストを吸引し、新しい15 mLチューブに移します。分取前に直ちに分取工程に進みます。共焦点レーザースキャニング顕微鏡（CLSM）を用い、488 nmの励起レーザーでプロトプラストを短時間観察し、プロトプラストの完全性とプロトプラストプールにおけるGFP蛍光の有無を確認します。分取ノズルの詰まりを防ぐため、細胞破片を最小限に抑える必要があります。分離したプロトプラストをTEX緩衝液中でFACSを用いて分取します。調整済みプロトコルに従い、システム圧力を約9 PSIに設定し、イベントレートを6,000から15,000の間として、マクロソートヘッドの200 µmノズルを使用します。野生型の非GFPプロトプラストを用いて、GFP陽性プロトプラストを回収するための自家蛍光閾値を決定し、488 nmのアルゴンラインで100 mWで動作するアルゴンレーザーを用いて細胞をソートします。GFP陽性プロトプラストの回収後、530/30バンドパスフィルターを用いてGFP蛍光を同定します。その後、発現プロファイリングのため、ソート開始前と同様に、ソートされたプロトプラストを顕微鏡下で観察します。分取したプロトプラストから全RNAを抽出します。その後、ハイブリダイゼーション用のcDNAを調製します。このcDNAを、TH one OPSYS Ametri全ゲノムアレイを用いてハイブリダイゼーションに供します。以下は、野生型コントロールのプロトプラスト分取における代表的な結果である。プロトプラストはGFP陽性ゲート内に信号を全く示さない。一方、GAL 4GFP系統から単離したプロトプラストサンプルではGFP陽性信号が確認される。分取前の野生型植物から単離したプロトプラストは、CLSM解析においてGFP蛍光を全く示さない。GAL 4G FP系統のプロトプラスト試料を分析した結果、GFP蛍光を発するものと発しないものが混在していることが検出されました。CLSM分析により、代表的なgal 4G FP系統からGFP陽性プロトプラストが単離されていることが示されています。単離したプロトプラストからはRNAを抽出可能であり、1 mLからフルオロスペクトロメトリーで検出するに十分な量のRNAが得られます。以上で、蛍光活性化細胞分級法（FACS）および細胞種特異的な遺伝子発現解析に向けた、atopy ANAからの葉プロトプラストの単離方法について説明しました。この手順を行う際は、プロトプラストの取り扱いに細心の注意を払い、光への曝露を制限することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

学ぶFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングでシロイヌナズナの組織特異的フィトクロム応答を調査する方法。この技術は植物の光応答メカニズム解明に有用です。

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