でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

特定の植物細胞型におけるフィトクロム応答を検討するため、GAL 4G FPエンハンサートラップ株とU-A-S-B-V-Rトランスジェニック株を交配させ、フィトクロム欠損株を作製した。U-A-S-B-V-RとGA 4G FPの交配から得られた子孫植物から葉プロトプラストを単離した。

次に、GFP陰性とGFP陽性のプロトプラストを別々のサンプルとして分離するため、FACSを用いてプロトプラストの分取を行います。分離したプロトプラストは共焦点レーザー走査顕微鏡で解析します。GFP陽性プロトプラストの回収を確認するため、プロトプラストからRNAを抽出し、スペクトル解析を行います。こんにちは、ミシガン州立大学エネルギー植物研究室のBARDA Montgomery研究室のSanka Pivarです。

本日は、蛍光活性化細胞分取（FACS）および細胞型特異的な遺伝子発現解析のために、Arabidopsis thalianaから葉プロトプラストを単離する手順をご紹介します。当研究室では、組織および器官特異的なフィトクロム依存的応答を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。

本手順で使用したArabidopsis ANA系統は、二分法的なエンハンサートラップ法を用いて作製されました。親系統の一つは、galの発現パターンが異なるエンハンサートラップ系統のライブラリーから得られたものです。また、もう一方の親系統は、上流活性化配列（UAS）の制御下でGFPを発現しています。

簡潔に述べると、転写因子GAL4はUASの制御下にあるあらゆる遺伝子を活性化します。親系統1では、GAL4がGFPを活性化します。親系統1を親系統2と交配させました。親系統2では、BVR遺伝子がUASを介してGAL4の制御下にあります。

交配によって得られた系統はU-A-S-B-V-R cross G 4G FPである。親系統では、フィトクロム色素体の生合成は、hemeを経てLAからbiver（略称bv）へと進行する。しかし、後代ではBVR遺伝子産物がBV前駆体を還元することにより、フィトクロム色素体の生合成を阻害する。このエンハンサートラップBVR後代系統は確認済みであり、活性フィトクロムレベルの低下が異なる植物組織にどのように影響するかを調べるために使用できる。

葉のプロトプラストを調製するために、植物の育成用土およびポットを準備することからこの手順を開始します。1回の実験につき1サンプルあたり約2000粒の滅菌済み種子を、ポット内の土壌に播種します。ポットを入れたトレーの底に水を加え、トレー全体をプラスチックラップで覆います。

白光照射下、22 °C、湿度70%の条件で植物を5週間育成します。最初の5〜6日後、種子の発芽を確認し、トレイからラップを取り除きます。プロトプラストを単離するために、まずTEXバッファーを調製します。バッファー1 L分として、GA's B 5 salts（MES、塩化カルシウム、硝酸アンモニウム、スクロース）を計量します。

約900 mLの脱イオン蒸留水（DD H2Oと略記）に成分を完全に溶解させます。1 M KOHを用いてpHを5.7に調整します。その後、最終容量を1 Lとし、フィルター滅菌を行います。

次に、植物から健康的で緑色の葉を採取します。ビーカーに葉を軽く詰め、約250 milliliters分を採取します。葉を40 millilitersで洗浄します。

20番のメスを用い、滅菌したDD H2Oで4回洗浄した後、さらに2回すすぎます。葉を細い帯状に切り、組織を2本の50 mL滅菌プラスチックチューブに等分して分注します。1x葉消化ミックスは、TEXバッファーに2% (w/v) のMazy R10および4% (w/v) のCellulase (on Azua R10) を溶解して調製した10xストック溶液の5 mL分注量を、45 mLの新鮮なTEXバッファーに加えることで調製します。

1×葉消化液を約25 milliliters加えます。各チューブ内の葉の断片に混ぜ合わせ、すべての葉組織が浸るようにします。真空浸透処理を行い、葉組織に消化液を浸透させます。

ウォーターポンプに接続した真空デシケーターを用い、開いたチューブの中で室温で1時間混合します。葉組織と葉消化ミックスを含むキャップチューブは、光への露出を防ぐためにアルミホイルで包んでください。続いて、ロッカーを用いて室温で3時間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。

3時間後、ロッカーの速度を2分間上げてプロトプラストを遊離させます。粗製プロトプラスト懸濁液を2層の滅菌チーズクロスでろ過してデブリを除去し、ろ液を滅菌ガラスビーカーに回収します。さらに、ろ液を滅菌済みの100 µmナイロンメッシュでろ過し、滅菌シャーレに回収します。

フロースルーを回収し、新しい滅菌済みの50 mLチューブに移します。約15 mLの新鮮なTEXバッファーを用いて滅菌済みのシャーレを洗浄し、表面に付着しているプロトプラストを回収します。フロースルーを、加速6、減速0に設定したスイングバケット型遠心機を用い、10 °Cで100 ×gにて15分間遠心分離します。

ペリスタルティックポンプに接続した滅菌済みの9インチガラス製パステールピペットを使用し、浮遊プロトプラスト層を乱さないように注意しながら、残渣やペレット状のデブリを含む浮遊プロトプラスト層下の液量を、10から50 mL残るまで、約25から30 mL除去します。ペレット状のデブリを除去した後、新鮮なTEXバッファーを加えて最終容量を40 mLにします。プロトプラストを穏やかに再懸濁させながら、デブリの除去と残った浮遊プロトプラストの再懸濁を繰り返します。

細胞デブリを可能な限り除去するため、さらに2回繰り返します。遠心分離の時間は、1回目の繰り返しでは10分に、最後の繰り返しでは5分に短縮します。最後に、滅菌済みの1 mL転送ピペットを使用して、浮遊しているプロトプラストを吸引し、新しい15 mLチューブに移します。

分取前に直ちに分取工程に進みます。共焦点レーザースキャニング顕微鏡（CLSM）を用い、488 nmの励起レーザーでプロトプラストを短時間観察し、プロトプラストの完全性とプロトプラストプールにおけるGFP蛍光の有無を確認します。分取ノズルの詰まりを防ぐため、細胞破片を最小限に抑える必要があります。分離したプロトプラストをTEX緩衝液中でFACSを用いて分取します。

調整済みプロトコルに従い、システム圧力を約9 PSIに設定し、イベントレートを6,000から15,000の間として、マクロソートヘッドの200 µmノズルを使用します。野生型の非GFPプロトプラストを用いて、GFP陽性プロトプラストを回収するための自家蛍光閾値を決定し、488 nmのアルゴンラインで100 mWで動作するアルゴンレーザーを用いて細胞をソートします。GFP陽性プロトプラストの回収後、530/30バンドパスフィルターを用いてGFP蛍光を同定します。その後、発現プロファイリングのため、ソート開始前と同様に、ソートされたプロトプラストを顕微鏡下で観察します。

分取したプロトプラストから全RNAを抽出します。その後、ハイブリダイゼーション用のcDNAを調製します。このcDNAを、TH one OPSYS Ametri全ゲノムアレイを用いてハイブリダイゼーションに供します。

以下は、野生型コントロールのプロトプラスト分取における代表的な結果である。プロトプラストはGFP陽性ゲート内に信号を全く示さない。一方、GAL 4GFP系統から単離したプロトプラストサンプルではGFP陽性信号が確認される。分取前の野生型植物から単離したプロトプラストは、CLSM解析においてGFP蛍光を全く示さない。

GAL 4G FP系統のプロトプラスト試料を分析した結果、GFP蛍光を発するものと発しないものが混在していることが検出されました。CLSM分析により、代表的なgal 4G FP系統からGFP陽性プロトプラストが単離されていることが示されています。単離したプロトプラストからはRNAを抽出可能であり、1 mLからフルオロスペクトロメトリーで検出するに十分な量のRNAが得られます。以上で、蛍光活性化細胞分級法（FACS）および細胞種特異的な遺伝子発現解析に向けた、atopy ANAからの葉プロトプラストの単離方法について説明しました。

この手順を行う際は、プロトプラストの取り扱いに細心の注意を払い、光への曝露を制限することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。