セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析
2010年4月9日
細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。
こんにちは、私の名前はリック・パスクアで、バージニア・コモンウェルス大学の化学・生命科学部の幹細胞工学研究室の学生です。このビデオでは、私たちの研究室が安価で自作のSTOスピン装置を使用して、細胞表面マーカーの定量化のためのヒト多能性幹細胞の観察可能な単層を作成する方法を実演します。多くのIMMUNOCHEMICALプロトコルがコロニーとしてチャンバースライドで増殖したh PSCに適応していることを考えると、個々の細胞レベルでのバイオマーカーの発現を特徴付ける際に問題が発生する可能性があります。
細胞を単層に持つことは、これらの視覚的分析だけでなく、おそらくそれらの発現を定量化するのにも役立ちます、私たちの研究室が使用する副鼻腔スピン装置は、ほとんどの研究室で見られる材料を使用して構築することができます小さな細胞サンプルのみを必要とし、特定の試薬の種類は必要ありません。そしてさらに重要なことに、観察のために単一細胞の広がりを確実に再現することができます。ここでは、シトシン装置を構築するために必要なものをいくつか紹介します。
プラスチック製のスライドは、これらは必ずしもきれいである必要はないので、必要に応じて古いチャンバースライドを使用できます。事前に洗浄されたスライドガラス。これらは、細胞単層が作成される場所であるため、洗浄する必要があります。
濾紙、どんな種類でもかまいません、そしてマイクロピペットのヒント。1〜10マイクロリットルのチップは、建設が始まる前に私たちの研究室が使用するものです。最初にプラスチック製のスライドに穴を開ける必要があります。
これは、ドリルプレスを使用して行うことができます。穴の直径は、マイクロピペットチップのサイズによって異なり、標準的な1〜10マイクロピペットチップに使用されるチップの最も広い部分の幅とほぼ同じである必要があります。これは約7ミリメートルである必要があります。
プラスチック製のスライドに作成する穴の量は、スライドの使用目的に完全に依存します。例えば、当研究室の免疫化学染色では、通常、ポジティブ染色用とネガティブバックグラウンドコントロール用の2つのホールを使用します。これらのスライドは、無期限に再利用できます。
濾紙の場合は、プラスチックスライドのパラメータに合わせて濾紙の一部を切り取るだけです。スライドの穴を基準にして、濾紙に穴を開けます。濾紙の穴のサイズは、ここに示すようにマイクロピペットの先端がぴったりと収まるように十分に大きくする必要があります。
次に、マイクロピペットの先端を適切な数、各穴の約半分の長さに1つずつ切り出す必要があります。これは、セルラーモノレイヤーが作成されるスライドガラスのベースとして機能します。次に、この上に濾紙をのせます。
濾紙は、懸濁液染色から余分な媒体を吸収するのに役立ちます。これは、装置の固体サポートとして機能するプラスチックスライドによって締めくくられます。その後、これを通常の家庭用テープで4面すべてを密封することができます。
最後に、マイクロピペットチップ全体を装置の切断チップに挿入します。これは、懸濁液染色後の細胞サンプルが置かれる場所になります。また、スライドガラスのどこにカットチップがあるかを最初にマークしておくと、より認識しやすくなる場合があります。
当研究室が使用する免疫化学懸濁液染色プロトコルでは、まず幹細胞を単一細胞懸濁液に回収します。これは、通常はトリプシンまたは非酵素的EDTAベースの細胞解離バッファーを使用して酵素によって行われます。次に、細胞を2 mlのマイクロ遠心チューブとその標準増殖培地である1 mlに移します。次に、これらを200Gで4分間遠心分離します。
同じ遠心分離速度が、結果として生じるすべての洗浄およびスピンダウンステップに使用されます。その後、培地を手動で吸引しますが、吸引中は細胞ペレットが邪魔されないように特に注意してください。次に、これを1mlのPBSで2回洗浄し、毎回スピンダウンして吸引します。
次のステップでは、これを作成するために必要な4%ペアのホルムアルデヒドまたはPFA試薬を使用して細胞を固定するか、このビデオの添付記事に記載されています。細胞を4%対のホルムアルデヒド溶液中でインキュベートし、室温で10分間放置します。このステップは、細胞スピン装置の使用のためにex 細胞外懸濁液を染色する前に実施することが推奨される。
その後、細胞をPBSで2回洗浄し、PFAの痕跡を取り除きます。その後、細胞をブロックして、不特異的な染色を防ぐ必要があります。前のステップでPBS洗浄した後、洗浄液を吸引し、ブロッキング溶液1mlを追加します。
その後、これを室温で約45分間放置します。ブロッキング溶液を待っている間に、一次抗体を推奨希釈してブロッキング溶液に希釈することで、一次抗体を調製することができます。これを摂氏4度で保管します。
細胞をブロッキング溶液に約45分間置いた後、スピンダウンしてこれを吸引し、一次抗体溶液に細胞を懸濁します。非特異的結合の検出とバックグラウンドコントロールの目的で、少なくとも1つのサンプルをネガティブとして保持するのが最善です。一次抗体は塗布されておらず、PBSに懸濁しているだけです。
すべてのサンプルを室温で約1時間放置します。必要に応じて、固定細胞を一次抗体溶液に懸濁液で一晩放置し、ブロッキング溶液で2回洗浄することができます。二次抗体溶液は、洗浄しながら作製することができます。
二次抗体は通常、光に敏感であるため、可能であればラボの照明を暗くし、使用する容器をアルミホイルで覆うようにして、蛍光漂白を防ぐためです。Antifa試薬はプロトコールに組み込むことができますが、ブロッキング溶液中の推奨濃度に希釈された一次抗体のようにバックグラウンドが高くなる可能性があるため、使用には注意が必要です。洗浄完了後に一次サンプルが追加されたかどうかに関係なく、すべてのサンプルに1つのvisを適用します。
これを瓶の中などの暗い場所に約1時間放置します。細胞を1mlのブロッキング溶液で2回洗浄します。これで、細胞はDPI色素による核染色の準備が整いました。
最初にPBSで1〜10,000希釈でDPI溶液を調製し、PBSの1mlで細胞を一度洗浄し、その後、dpiで懸濁し、室温で約5〜10分間放置します。二次抗体と同様に、DAPIは光感受性であるため、蛍光や漂白を防ぐために必要な調整を行ってください。1mlのPBSで一度洗い、最後にreusで洗います。
1mlのPBSで再度懸濁します。その後、これをサイトスピン装置で使用する準備ができているはずです。最大100マイクロリットルのシングルセル溶液をマイクロピペットチップの上部に最適に置きます。
ただし、不必要なオーバーフローや滴りを防ぐために、少量をお勧めします。その後。サイトスピン装置とカウンターバランスを机上の遠心分離機に置き、1000 RPMで4分間スピンダウンします。その後、細胞がスライドガラスから剥がれる可能性が最小限になるように、細胞スピン装置を慎重に分解します。
取り付ける前に、蛍光顕微鏡で立っていることを確認してください。これらは、細胞スピン装置からSSCA 4細胞表面マーカーで染色されたBG one V細胞の単層を撮影した写真です。細胞が互いに分離されているため、シングルセルの観察と記録が可能になっていることに注目してください。
このプロトコールの良いところは、実現可能で、費用対効果が高く、幹細胞培養の日常的な分析に容易に適応できる単層細胞を再現できることです。それでは、このビデオを描いて、自分の研究で使用するプロトコルを見つけていただければ幸いです。
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概要
この記事は、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の免疫細胞化学的染色のための自作のサイトスピン装置の使用を示しています。この方法により、細胞の単層を作成し、細胞表面マーカーの観察と定量化を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞工学
- 免疫細胞化学
- 細胞生物学
背景
- ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、様々な研究応用に重要です。
- 標準的な免疫化学的プロトコルは、コロニーで培養されたhPSCsに適用する際に課題に直面することがあります。
- 個々の細胞レベルでのバイオマーカーの特徴づけは、正確な分析に不可欠です。
- 細胞の単層は、細胞表面マーカーの視覚的分析と定量化を改善します。
研究の目的
- 分析のためのhPSCsを準備する費用対効果の高い方法を示す。
- 細胞表面マーカーの観察と定量化の信頼性を向上させる。
- 容易に入手可能な材料を使用した再現可能な技術を提供する。
使用された方法
- 自作のサイトスピン装置の構築。
- hPSCsの単層の準備。
- 細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）の免疫細胞化学的染色。
- 染色された細胞の定量化と観察。
主な結果
- サイトスピン装置は効果的にhPSCsの単層を作成します。
- 細胞表面マーカーを信頼して観察し定量化できます。
- この方法は再現可能で、特定の試薬を必要としません。
- 個々の細胞の視覚的分析が向上します。
結論
- 自作のサイトスピン装置は、幹細胞研究の価値あるツールです。
- この方法は、hPSCsの免疫細胞化学的分析における課題に対処します。
- 将来の応用は、様々な研究設定でこのアプローチの恩恵を受ける可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Characterizing human pluripotent stem cells at single-cell resolution is critical for target validation and assay development in early discovery. This self-made cytospin method enables reproducible monolayer preparation, supporting quantitative immunocytochemical analysis of surface markers like SSEA-3/SSEA-4. The approach reduces technical variability and enhances predictive confidence in stem cell-based models used for mechanistic de-risking and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through single-cell biomarker quantification in hPSC colonies.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying expression patterns of pluripotency markers at individual cell resolution.
- Predictive Value: Improves assay readiness for downstream screening by generating consistent, observable cell monolayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by ensuring uniform cell distribution and marker accessibility.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through controlled cytospin processing and minimal reagent dependence.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple staining conditions with low-cost, reusable apparatus components.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains phenotypic fidelity from discovery through preclinical validation by preserving cell integrity during monolayer formation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of surface marker expression with differentiation potential in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by providing quantifiable, single-cell data for pluripotency assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling reliable preparation of hPSCs for immunocytochemical analysis, bridging colony-based culture and single-cell resolution assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing precise quantification of pluripotency markers in individual cells.
- Screening: Delivers assay-ready monolayers with high reproducibility, reducing false variability in marker detection.
- Analytics: Generates quantitative imaging outputs (e.g., fluorescence intensity per cell) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic characterization of hPSC-derived models.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, cost-effective capability for routine stem cell quality control across projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pluripotency assessment.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through simple construction and reusable components.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling accurate, single-cell-based biomarker scoring.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell lines based on quantifiable marker expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture and microscopy expertise for suspension preparation and fluorescence imaging.
- Needs access to a desktop centrifuge and standard lab supplies (glass slides, filter paper, pipette tips, tape).
- Demands standardization of spin speed, duration, and sample volume across users for reproducible monolayer formation.
- Adaptation to different cell types may require optimization of dissociation and blocking conditions.
- Limited to adherent-compatible cells; not suitable for non-adherent or fragile primary suspensions without modification.
