セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析

こんにちは。私はバージニア・コモンウェルス大学化学生命科学部の幹細胞工学研究室の学生、Rick Pasquaです。このビデオでは、細胞表面マーカーの定量化のために、ヒト多能性幹細胞の観察可能な単層を作成する、安価で自作のSTOスピン装置の使用方法を実演します。多くの免疫化学プロトコルは、チャンバースライド内でコロニーとして増殖させたhPSCに適応させているため、個々の細胞レベルでバイオマーカーの発現を特性評価する際に問題が生じることがあります。

細胞を単層にすることで、視覚的な解析だけでなく、発現量の定量化も容易になります。当研究室で使用しているサイナス・スピン装置（sinus spin apparatus）は、ほとんどの研究室にある材料で構築でき、少量の細胞サンプルのみで、特定の試薬も必要ありません。そしてより重要な点として、観察のために単一細胞を信頼性高く分散させることが可能です。以下に、このサイトシン装置を構築するために必要なものを挙げます。

プラスチック製スライドは、必ずしも清潔である必要はないため、必要に応じて古いチャンバースライドを使用しても構いません。あらかじめ洗浄済みのガラススライドを用意してください。細胞単層を形成させる場所となるため、これらは洗浄しておく必要があります。

フィルターペーパー（種類は不問）とマイクロピペットチップを用意します。当研究室では、作製を開始する前に1〜10 µL用のチップを使用しています。まず、プラスチックスライドに穴を開けます。

これは卓上ボール盤を使用して行うことができます。穴の直径はマイクロピペットチップのサイズによって異なります。標準的な1～10 µLマイクロピペットチップを使用する場合、チップの最も太い部分の幅と同程度にする必要があります。これは約7 mmになります。

プラスチックスライドに作成する穴の数は、使用目的に完全に依存します。例えば、当研究室の免疫化学染色では、通常、陽性染色用と陰性バックグラウンドコントロール用の2つの穴を作成しています。これらのスライドは、回数制限なく再利用することが可能です。

フィルターペーパーについては、プラスチックスライドの寸法に合わせて切り出します。スライドの穴を基準にして、フィルターペーパーに穴を開けます。フィルターペーパーの穴のサイズは、ここに示されているように、マイクロピペットのチップがぴったりと収まる十分な大きさにしてください。

次に、マイクロピペットチップを適切な数（各穴につき1本）、長さの約半分で切り出します。これが、細胞単層を形成させるためのガラススライドの土台となります。続いて、この上にフィルターペーパーを載せます。

ろ紙は、懸濁染色による過剰な培地を吸収させるために使用します。その上にプラスチック製スライドを重ね、装置の強固な支持体とします。最後に、周囲の4辺を一般的な家庭用テープで密封します。

最後に、マイクロピペットチップを装置の切断したチップ部分に完全に挿入します。ここに、懸濁染色後の細胞サンプルを配置します。また、あらかじめガラススライド上の切断チップの位置をマークしておくと、識別が容易になり便利です。

当研究室で使用している免疫化学的懸濁染色プロトコルでは、まず、トリプシンを用いた酵素的消化、またはEDTAベースの非酵素的細胞解離バッファーを用いて、幹細胞を単一細胞懸濁液として回収します。その後、細胞を1 mLまたは2 mLのマイクロ遠心チューブに移し、標準的な増殖培地を加えます。これらを200 Gで4分間遠心分離します。

以降のすべての洗浄および遠心分離ステップでは、同じ遠心速度を使用します。その後、培地を手動で吸引しますが、細胞ペレットを乱さないよう、吸引時は細心の注意を払ってください。次に、1 mlのPBSで2回洗浄し、その都度、遠心分離と吸引を行います。

次のステップでは、4% パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて細胞を固定します。この試薬の調製に必要なものは、本動画に付随する解説に記載されています。細胞を 4% パラホルムアルデヒド溶液中でインキュベートし、室温で 10 分間放置します。この工程は、細胞外懸濁液の調製およびサイトスピン装置を用いた染色の前に行うことが推奨されます。

その後、PFAの残留物を取り除くために、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、非特異的な染色を防ぐために細胞をブロッキングします。前ステップのPBS洗浄後、洗浄液を吸引し、1 mlのブロッキング溶液を加えます。

その後、室温で約45分間放置します。ブロッキング溶液による処理を待っている間に、一次抗体を推奨の希釈倍率でブロッキング溶液に希釈し、準備することができます。これは4 °Cで保存してください。

細胞をブロッキング液に約45分間浸した後、遠心分離して上清を吸引し、一次抗体溶液で再懸濁します。非特異的結合とバックグラウンドのコントロールとして検出するためには、少なくとも1つのサンプルをネガティブコントロールとして保持することが最適です。これは一次抗体を添加せず、単にPBSで再懸濁したものです。

すべてのサンプルを室温で約1時間放置します。必要に応じて、固定細胞を一次抗体溶液中で一晩懸濁状態で保持し、ブロッキング液で2回洗浄しても構いません。洗浄を行っている間に、二次抗体溶液を調製できます。

二次抗体は通常、光に敏感であるため、可能であれば研究室の照明を落とし、使用する容器をアルミホイルで覆ってください。これは蛍光退色を防ぐために行われます。Antifa試薬をプロトコルに組み込むことも可能ですが、ブロッキング溶液で推奨濃度に希釈した一次抗体と同様に、背景（バックグラウンド）が高くなる可能性があるため、使用には注意が必要です。洗浄完了後、一次抗体の添加有無にかかわらず、すべてのサンプルにVISを適用します。

これをジャーの中などの暗所に約1時間置いておきます。ブロッキング溶液1 mlで細胞を2回洗浄します。これで、DPI染料を用いた核染色の準備が整ったことになります。

まず、DPI溶液をPBSで1:10,000に希釈して調製します。細胞を1 mLのPBSで1回洗浄した後、DPI懸濁液に再懸濁し、室温で約5〜10分間静置します。二次抗体と同様に、DAPIは光感受性があるため、蛍光退色を防ぐために必要な措置を講じてください。1 mLのPBSで1回洗浄し、最後に再懸濁します。

さらに1 mlのPBSで懸濁します。これでサイトスピン装置での使用準備が整います。単細胞溶液を最大100 µLまでマイクロピペットチップの上部に分注します。

不必要なオーバーフローや液だれを防ぐため、少なめの量を使用することが推奨されます。その後、サイトスピン装置とカウンターバランスを卓上遠心機にセットし、1000 RPMで4分間遠心分離します。終了後、細胞がガラススライドから脱落する可能性を最小限に抑えるように、慎重にサイトスピン装置を分解してください。

マウントする前に、蛍光顕微鏡下で定着が行われたことを確認してください。これらは、サイトスピン装置を用いてSSCA 4細胞表面マーカーで染色したBG 1 V細胞の単層写真です。細胞が互いに独立しており、単一細胞の観察と記録が可能であることに注目してください。

このプロトコルの利点は、実行可能で費用対効果が高く、幹細胞培養のあらゆる日常的な解析に容易に適応できる単層細胞を再現できることです。以上のことから、このビデオがお役に立ち、このプロトコルをご自身の研究で活用していただけることを願っております。