Name: セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ セルフメイドサイトスピン装置を用いたヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的手法。SSEA-3/SSEA-4などの細胞表面マーカーの定量化と可視化が可能で、個別細胞レベルでの正確な解析を実現する再現性の高い技術です。

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この仕事のための資金の一部は、NSF - CAREER 0744556（ラオ）とVCU - HHMI科学教育研究プログラム（パスク）を通じて、奨学金によって提供されていました。

パート1：サスペンション免疫細胞化学染色<ol><li>細胞は、単一の細胞懸濁液に収穫される。 </li><li>次に、細胞を1.5 - 2mLのマイクロチューブに移し、4分間200グラムで遠心分離されています。 </li><li> （のMg 2なし+及びCa 2 +）とし、4分間、200グラムで、再び遠心分離-細胞は、PBS 1mLのに再懸濁し、上清を吸引することによって洗浄される。これを2回行う必要があります。 </li><li>洗浄後、細胞を10分間室温で4％パラホルムアルデヒド（PFA）の1mLのにそれらを再懸濁させることによって固定されています。 </li><li>細胞をPBS液1mLを再度2回洗浄されている - 。 </li><li>洗浄後、ブロック液の1mLの（6％serum/94％PBS - ）でそれらを再懸濁することによりブロックの細胞。 45分間室温でこれらをインキュベートする。 </li><li>後、4分間200グラムでチューブを遠心し、ブロックのソリューションを吸引除去する。一次抗体溶液（推奨希釈率でブロックソリューションで作られた）の1mlの細胞を再懸濁する。細胞は、どちらか1時間または4℃で一晩、次の手順に進む前に、室温でインキュベートすることができます。 </li><li>次に、細胞をブロックソリューション液1mLで2回洗浄する。 </li><li>後、二次抗体溶液の1mlの再サスペンド細胞（推奨希釈度でブロックソリューションで作られた）と1時間室温でインキュベートする。 </li><li> 1時間後、細胞はその後、ブロックのソリューション液1mLを再度2回洗浄する必要があります。 </li><li>ブロックソリューションで洗浄後、PBS液1mLで再び細胞を洗浄 - 。 </li><li>様々な洗浄後、1mLの中で細胞を再懸DAPI核染色（PBS中のDAPIの1:10,000希釈 - ）と室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 5分後、4分間200グラムでチューブを遠心する。 - PBS液1mLにDAPI核染色液と再サスペンド細胞を吸引除去する。 </li></ol>パート2：サイトスピン装置によって生成されたスライドのhPSCsの取り込み<ol><li>プラスチック製のスライドは、ドリルを押すだけで、それらの穴の望ましい量を加えることによって調製される。直径は、ほとんどの1ミリメートルで使用するマイクロピペット先端（s）の広い直径よりも大きくする必要があります。 </li><li>ろ紙は、ハサミでプラスチック製のスライドのパラメータにカットされます。 </li><li>セキュリティホールは、濾紙で作られています。穴の大きさ（s）はマイクロピペットの先端（s）はそれを介してぴったり収まるように十分な大きさでなければなりません。 </li><li>後は、準備プラスチックのスライドの一つは、上部とカットフィルター紙の下部（図1）に配置されたのスライドガラス上に配置されます。層は、テープで固定されています。 </li><li>パート1から汚された細胞懸濁液の100μLの最大は、（希望する単層の密度に応じて）その後、マイクロピペット先端（s）の上部に配置されます。 </li><li>必要に応じて、細胞溶液を持つ装置を秤量し、同じような重量のカウンターバランスを作成することができます。 </li><li>サイトスピン装置とカウンターバランスは、デスクトップ遠心分離機に入れ、4分間、200グラムで遠心分離されることができる。 </li><li>遠心分離後、サイトスピン装置を慎重にスライドガラスから細胞を取り除きますdoesntのように逆アセンブルされます。 </li><li>必要に応じて、過剰な周囲のPBS - ガラス側には出吸引。 </li><li>次いで、細胞を、目的の細胞単層が達成されたかどうかを確認するために蛍光顕微鏡を使用して表示することができます。 </li></ol>パート3：取付スライド<ol><li>希望されている実装メディアの低下は細胞を含む各地域の中心部に配置されます。 </li><li>後、カバースリップを静かに、可能であれば、気泡を回避しようとスライド上に低下する。 </li><li>過剰マウントメディアは、スライドから削除されます。 </li><li>後は、カバーガラスの側面は、マニキュアで密封されています。 </li><li>結果が観察され、文書化されるまでスライドは暗い記憶領域に保つことができます。 </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちの研究室の目的のためには、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）上に成長させた幹細胞培養の35mmディッシュは、サイトスピン装置で使用するための免疫細胞化学染色の手続きのために割り当てられます。その後、細胞を単一細胞懸濁液に、可能な限りMEF層のを除去する、継代酵素によって収集されます。 MEFの層から、より効果的な幹細胞の分離が必要な場合は、コロニーを手動で懸濁液に消化してピックアップすることができます。フィーダーフリーの条件が、幹細胞培養の成長に使用されている場合、コロニーは単に掻きと懸濁液に消化することができます。最初の単一細胞懸濁液が理想的ですが、任意の細胞塊は、効果的に免疫細胞化学的染色法で求め、多くの洗浄と再懸濁のステップを通して離れて分割する必要があります。 ビデオでは、染色hPSCsのための細胞外マーカーの使用に焦点を当てた。 hPSCsの細胞内染色が所望される場合、ブロックSolutionの添加（ステップ1.6）の前に追加のステップは、細胞を透過処理溶液の1mLの（ツイーン20の25μlの持つ高塩分バッファーの50mLs）で3回洗浄される、請求を実行する必要がある前...

<table><tbody><tr><td>Lab Tek Permanox チェンバースライド</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>再利用可能なプラスチックスライド用材料</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus プレクリーンド顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10&amp;mu;L フィルターチップ</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用カバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗SSEA-4モノクローナル抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>SSEA-4染色の一次抗体</td></tr><tr><td>ラット抗SSEA-3モノクローナル抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>SSEA-3染色の一次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>SSEA-4染色の二次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗ラット IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>SSEA-3染色の二次抗体</td></tr><tr><td>DAPI 二塩酸塩</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

ヒト胚性幹細胞（ヒトES）とヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むヒト多能性幹細胞（hPSCsは）彼らの無限の自己複製機能と、複数の細胞型に分化する潜在能力に起因する刺激的な細胞源です。 hPSCsの多能性状態は、典型的には、定量PCR、免疫細胞化学などの手法によって評価され、その他で<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em&gt; in vivoで</em複数の細胞型へ&gt;差別化戦略。これらの中でも、免疫細胞化学的手法は、候補細胞内および細胞表面マーカーの分析に基づいてhPSCsの未分化状態の日常的特性評価のために開発されている。 hPSCsがコロニーとして成長しているという事実を考えると、問題は定期的に個々の細胞レベルでこれらのマーカーの発現を定量化するに生じる。フローサイトメトリー分析は、この問題に対処するが、細胞数を必要とし、通常はhPSC文化の日常的な品質管理の評価のための助長ではない試薬を使用するのに役立つ。このように、マーカーの評価のために保存整合性と単層の細胞サンプルの作成の実践的かつ再現可能な手段の開発は、幹細胞研究の多くの利点があります。単分子層からの個々の細胞が容易に特定のマーカーの発現について観察し、定量化できるため、これは大幅に免疫細胞化学的分析に利益をもたらします。この目標に向けて、自作サイトスピン装置が建設され、免疫細胞化学染色の使用に最適化。二つの細胞表面マーカー（SSEA3/SSEA4）式は、このプロトコルの目的のためにバリアントBG01の幹細胞株で分析した。

細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。

ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）を含むヒト多能性幹細胞（hPSC）は、非常に期待されている細胞であり、...

こんにちは。私はバージニア・コモンウェルス大学化学生命科学部の幹細胞工学研究室の学生、Rick Pasquaです。このビデオでは、細胞表面マーカーの定量化のために、ヒト多能性幹細胞の観察可能な単層を作成する、安価で自作のSTOスピン装置の使用方法を実演します。多くの免疫化学プロトコルは、チャンバースライド内でコロニーとして増殖させたhPSCに適応させているため、個々の細胞レベルでバイオマーカーの発現を特性評価する際に問題が生じることがあります。細胞を単層にすることで、視覚的な解析だけでなく、発現量の定量化も容易になります。当研究室で使用しているサイナス・スピン装置（sinus spin apparatus）は、ほとんどの研究室にある材料で構築でき、少量の細胞サンプルのみで、特定の試薬も必要ありません。そしてより重要な点として、観察のために単一細胞を信頼性高く分散させることが可能です。以下に、このサイトシン装置を構築するために必要なものを挙げます。プラスチック製スライドは、必ずしも清潔である必要はないため、必要に応じて古いチャンバースライドを使用しても構いません。あらかじめ洗浄済みのガラススライドを用意してください。細胞単層を形成させる場所となるため、これらは洗浄しておく必要があります。フィルターペーパー（種類は不問）とマイクロピペットチップを用意します。当研究室では、作製を開始する前に1〜10 µL用のチップを使用しています。まず、プラスチックスライドに穴を開けます。これは卓上ボール盤を使用して行うことができます。穴の直径はマイクロピペットチップのサイズによって異なります。標準的な1～10 µLマイクロピペットチップを使用する場合、チップの最も太い部分の幅と同程度にする必要があります。これは約7 mmになります。プラスチックスライドに作成する穴の数は、使用目的に完全に依存します。例えば、当研究室の免疫化学染色では、通常、陽性染色用と陰性バックグラウンドコントロール用の2つの穴を作成しています。これらのスライドは、回数制限なく再利用することが可能です。フィルターペーパーについては、プラスチックスライドの寸法に合わせて切り出します。スライドの穴を基準にして、フィルターペーパーに穴を開けます。フィルターペーパーの穴のサイズは、ここに示されているように、マイクロピペットのチップがぴったりと収まる十分な大きさにしてください。次に、マイクロピペットチップを適切な数（各穴につき1本）、長さの約半分で切り出します。これが、細胞単層を形成させるためのガラススライドの土台となります。続いて、この上にフィルターペーパーを載せます。ろ紙は、懸濁染色による過剰な培地を吸収させるために使用します。その上にプラスチック製スライドを重ね、装置の強固な支持体とします。最後に、周囲の4辺を一般

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