慢性サルモネラ感染マウスモデル

この手順の全体的な目的は、慢性サルモネラ感染マウスモデルを確立することです。まず、サルモネラ溶液を調製します。次に、マウスにストレプトマイシンを投与し、続いてサルモネラを投与するか、あるいはストレプトマイシンのみを投与します。

手順の第3ステップでは、マウスの糞便からサルモネラを分離し、BLクロマプレートを用いてマウスの腸管におけるサルモネラ感染を検出します。手順の最終ステップでは、マウスの体重を観察・記録し、サルモネラ感染後の活力の変化に注意を払います。最終的に、サルモネラを経口投与したマウスの腸管において、サルモネラ感染が成立することを示す結果を得ることができます。

こんにちは。私はロチェスター大学医学部のジョンソン博士の研究室のミシェルPです。また、サン研究室のYです。本日は、Alytic Lennar感染マウスモデルの作製手順について解説します。

私たちは、宿主細菌相互作用のシグナル伝達および腫瘍形成を研究するために、研究室でこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。実験を開始する前に、各サルモネラ株に対して、実験全体で使用するのに十分な量のルリア・ベルタニ（LB）液体培地およびLBプレートを準備してください。

プレートは冷蔵して数ヶ月間保存可能です。次に、サルモネラ培養液を調製します。−80°Cで凍結保存したサルモネラのストックバイアルを取り出し、室温で解凍してサルモネラをプレートに播種します。

白金耳をバーナーで加熱滅菌し、解凍した細菌ストックに浸します。LBプレートの上部3分の1の領域に、白金耳をジグザグに動かして塗抹します。再び白金耳を火炎滅菌し、プレートを回転させます。

ループをジグザグに動かして前の画線と交差させ、プレートの2番目の3分の1の領域に細菌を広げます。これをもう一度繰り返します。その後、再びループを火炎滅菌します。

ループがアガーに刺入されないようにしてください。プレートを37 °Cのインキュベーターに一晩保管し、コロニーを成長させます。正しく行われていれば、サルモネラ菌のプレートの少なくとも1つのセクションに単一コロニーが形成されます。

翌日。滅菌済みのつまようじまたは白金線を用いてLBプレートからクローンをピックアップし、12 mLチューブに入れた7 mLのLB培地に接種します。チューブを37 °Cで約5時間振とうします。

この培養液0.05 millilitersを用いて、Falconチューブに入れた50 millilitersのLBに接種します。37 degrees Celsiusで、振盪せずに約18時間インキュベートします。

室温にて、50 milliliterの細菌 overnight 培養液を5,000 RPMで10分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、細菌を再懸濁するため、チューブに1.5 millilitersのHank's buffered salt solution（HBSS）を添加します（LBとHBSSの比率が100:3になります）。その後、HBSSを加えて全量を15 millilitersに調整します（LBとHBSSの比率が1:10になります）。

各マウスに100 µLの希釈サルモネラ培養液、すなわち1×10⁶から1×10⁸ CFUを投与します。ガバージュを開始する4時間前から、マウスへの水と餌の給与を停止してください。次に、7.5 mgのストレプトマイシン粉末を100 µLのHBSSで希釈し、ガバージュの直前にストレプトマイシン溶液を調製します。投与するマウス1匹につき、ガバージュ時の損失分を考慮して、多めの容量を調製するようにしてください。

まず、100 µLのストレプトマイシン溶液を充填した投与針を準備します。経口投与を行うため、ケージから1匹目のマウスを取り出し、ベンチトップに向くように保持します。親指と中指でマウスの肩の皮膚をしっかりと掴み、人差し指で頭部と頸部を伸ばして、食道を直線状にします。

給餌針のボールチップを口蓋に沿って、咽頭後壁の右側に向けて進めます。その後、慎重に食道へと挿入し、100 µLのストレプトマイシン溶液を注入します。このとき、抵抗が感じられないようにしてください。

実験群および対照群のすべてのマウスに対してこの工程を繰り返します。ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンの経口投与から約20時間後、かつサルモネラ経口投与の4時間前に、サルモネラ経口投与を行うマウスから水と餌を除去します。HBSSで調製した100 µLのサルモネラ溶液を用い、前回と同様の方法で各マウスに経口投与を行います。

経口投与後、各マウスを新しいケージに移し、糞便の回収を開始します。投与から約8時間後から、糞便が排泄された直後にケージから回収します。実験サンプルとして、マウスの糞便を100 mg回収してください。

糞便中のサルモネラ分析のため、研究期間に応じて毎日または毎週サンプルを採取します。糞便サンプルを1 mLのPBSと共に1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、激しくボルテックスした後、800 RPMで10分間遠心分離します。上清を清潔な1.5 mLチューブに移し、6,000 RPMで5分間遠心分離します。

上清を廃棄し、200 µLのPBSをペレットに加えてボルテックスで再懸濁させます。次に、BB l roagプレートを用いてサルモネラを検出します。糞便溶液を1プレートあたり10〜100 µL使用し、セクション2で示した方法でプレート上に塗抹します。

選択された発色剤の存在下での代謝の違いにより、サルモネラ属菌は赤色を呈します。プレート上のサルモネラ属菌のコロニー数を計数し、個々のマウス間での感染レベルを比較します。本実験手順では、生後6〜7週の特定病原体フリー（SPF）のC57BL/6雌マウスを使用しました。

マウスにサルモネラおよびストレプトマイシンを含むHBSSを感染させました。対照群のマウスにはストレプトマイシンのみをガバージ投与しました。使用したサルモネラ株には、野生型株のSalmonella typhimurium ATCC 14028S FPC、非病原性サルモネラ変異株、および低コピープラスミドpSKW29に病原性関連遺伝子AAV R ageを保持するJames Madera博士の研究室由来の3つのFPC株が含まれます。このプロトコルを用いることで、マウスの腸管内におけるSalmonella typhimuriumの定着を検出することが可能です。

慢性サルモネラ感染は糞便分析によって測定し、免疫蛍光染色のために体重および腸管組織サンプルを採取しました。通常、体重減少と死亡は感染後4週間以内に起こります。感染後4週間時点での生存率をここに示します。

感染後4週間を生存したマウスは、その後23週間にわたって体重が増加し、死亡率が低下します。全体として、サルモネラ株FSY fsy、A VRA null、またはfsy A VRA ヘテロ接合体に感染したマウスの65%以上が、腸内にサルモネラ感染を維持したまま6ヶ月以上生存することが可能です。

急性感染後も生存個体にはサルモネラが保持されており、本プロトコルに記載の方法を用いることで、感染から6か月後に検出することができました。マウス腸管の組織サンプルの免疫蛍光分析により、感染から27週後における腸粘膜へのサルモネラの侵入が示されています。この画像では、核が青色に、サルモネラ感染部位が緑色に染色されています。

コントロール群に示されているように、明るい緑色の染色は認められず、これはサルモネラの定着がないことを示しています。一方、感染後27週のサルモネラ感染マウスでは、腸粘膜に明るい緑色の染色が見られます。このことは、ストレプトマイシン前処理を施したマウスにおいて、サルモネラ感染が持続していることを示しています。

マウスモデルにおける慢性感染の誘導方法について説明しました。この手順を行う際は、接種用に培養物を新鮮に調製すること、適切な接種技術を用いること、そして実験モデルが正しく機能しているかを確認するためにANAの存在を検出することが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。