慢性サルモネラ感染マウスモデル

この手順の全体的な目標は、慢性サルモネラ菌に感染したマウスモデルを確立することです。これは、最初にサルモネラ菌溶液を調製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、マウスをストレプトマイシンで強制し、続いてサルモネラ菌またはストレプトマイシンのみを強制することです。

手順の3番目のステップは、マウスの糞便からサルモネラ菌を分離し、BLクロマプレートを使用してマウスの腸内のサルモネラ菌感染を検出することです。手順の最後のステップは、マウスの体重を観察して記録し、サルモネラ菌感染後の活力の変化を記録することです。最終的には、サルモネラ菌で強制経口投与したマウスの腸内でサルモネラ菌の感染が確立されることを示す結果を得ることができます。

こんにちは、ロチェスター大学医学部のジョンソン博士研究室のミシェル・Pです。私もサンラボの出身で、Yはサンラボの出身です。本日は、Alytic Lennar感染質量モデルを確立する手順をご紹介します。

私たちはこの手順を使用して、宿主細菌の相互作用、シグナル伝達、および腫瘍の発生を研究するための作業を行っています。それでは始めましょう。実験の前に、各サルモネラ菌株に十分な量のルリア、ベルティ、またはLBブロスプレートを準備し、実験全体で使用できます。

プレートは冷蔵して数ヶ月間保存できます。次に、サルモネラ菌培養物を準備します。摂氏マイナス80度で冷凍したストックサルモネラ菌のバイアルを取り出し、カウンタートップで解凍してサルモネラ菌の炎をプレート

バンズとバーナーに接種ループをし、解凍したバクテリアストックに浸します。LBプレートの上部3分の1でループを前後にジグザグに動かします。ループを再度炎上させ、プレートを回転させます。

ループをジグザグに動かして前の縞を横切り、プレートの2/3にバクテリアを広げます。もう一度繰り返します。再びループを炎上させます。

ループを寒天に侵入させないでください。プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩保存することにより、コロニーが成長するのを待ちます。正しく行われれば、サルモネラプレートは少なくとも1つのセクションで個々のコロニーを生成するはずです。

翌日。滅菌爪楊枝または細菌ループを使用してLBプレートからクローンを取り出し、12ミリリットルのチューブに7ミリリットルのLBを入れます。チューブを摂氏37度で約5時間振ってください。

この培養物の0.05ミリリットルを使用して接種します。 ファルコンチューブに50ミリリットルのLBを接種します。摂氏37度で約18時間振とうせずにインキュベートします。

50ミリリットルの細菌を室温で5, 000 RPMで一晩培養し、上清を捨てます。次に、1.5ミリリットルのハンク緩衝塩溶液またはHBSSをチューブに加えて、バクテリアを再懸濁するか、100部ポンドから3部のHBSSを再懸濁します。次に、HBSSで総容量を15ミリリットルにするか、LBとHBSSの比率を1対10にします。

各マウスは、実験の4時間前にマウスからの強制回収水と食物の採取を開始する前に、100マイクロリットルの希釈サルモネラ菌培養物、または10倍から6倍から10倍から8コロニー形成単位を必要とします。次に、7.5ミリグラムの粉末ストレプトマイシンを100マイクロリットルのHBSSに希釈することにより、強制執行の直前にストレプトマイシンの溶液を調製します。マウスを注入するごとに、マウスの強制経口投与前に損失を考慮して、追加のボリュームを準備してください。

まず、100マイクロリットルのストレプトマイシン溶液で栄養針を準備します。強制力を受けるケージから最初のマウスを取り外し、マウスをベンチトップに向けて保持します。親指と中指でマウスの肩越しに皮膚をしっかりとつかみ、人差し指で頭と首を伸ばして食道をまっすぐにします。

栄養針のボール先端を口蓋に沿って咽頭の後ろの右側に向けます。次に、それを食道にそっと渡し、100マイクロリットルのストレプトマイシン溶液を注入します。抵抗を感じるべきではありません。

実験中のすべてのマウスと実験中のコントロールについて、このプロセスを繰り返します。ストルプ・デ・ムおよび強制経口投与の約20時間後、およびサルモネラ強制経口投与を受けるマウスから水分と食物を採取する。HBSS中のサルモネラ菌溶液100μリットルを使用して、以前と同じ方法で各マウスを強制します。

強制後、各マウスを新しいケージに移して、糞便収集を開始します。強制経口投与後8時間前後から、落下後すぐにケージから糞便を取り出します。実験サンプルとしてマウスの糞便を100ミリグラム収集します。

糞便サルモネラ菌分析のための研究期間に応じて、毎日または毎週サンプルを収集します。糞便サンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1ミリリットルのPBSとともに移し、800RPMで10分間激しく遠心分離します。上清をきれいな 1.5 ミリリットルのチューブ遠心分離機に移し、6, 000 RPM で 5 分間行います。

上清を捨て、ペレットの渦に200マイクロリットルのPBSを加えて再懸濁します。次に、BB l roagプレートでサルモネラ菌を検出します。セクション2に示すように、プレート上に広がるプレートごとに10〜100マイクロリットルの糞便溶液を使用します。

サルモネラ菌種は、選択された発色物質の存在下での代謝の違いにより、色がマールに見えます。プレート上のサルモネラ菌のコロニーを数え、個々のマウス間の感染レベルを比較します。この実験手順では、6〜7週齢の特定の病原体を含まない雌C 57黒6匹マウスを使用しました。

マウスはサルモネラ菌とストレプトマイシンに加えてHBSSに感染しました。マウスは、ストレプトマイシンのみのサルモネラ菌株を使用して強制経口投与を制御されました。これには、サルモネラ菌の野生型株、A TCC 1 4 0 2 8 S FP C、非病原性サルモネラ変異株、およびPSKW 29の病原性関連AAV Rage遺伝子、低コピープラスミドを保有するJames Madera博士の研究室からの3つのFPC株が含まれます。このプロトコルを使用すると、サルモネラ菌のコロニー形成をマウスの腸で検出できます。

慢性サルモネラ菌感染症を糞便分析により測定し、体重と腸の組織サンプルを採取して免疫蛍光染色を行いました。通常、体重の減少と死亡は感染後4週間以内に起こります。感染後4週間の生存率をこちらに示します。

マウスが感染後4週間生存すると、マウスは体重が増加し、残りの23週間で死亡事故が減少します。全体として、サルモネラ菌株、FSY fsy、A VRA nullまたはfsyに感染したマウスの65%以上。VRAヘテロ接合体は、腸内でサルモネラ菌に感染し続けても6か月以上生存できます。

急性感染後も生存者はサルモネラ菌を保有しており、このプロトコルに記載されている方法を使用して感染後6か月で検出できました。マウス腸からの組織サンプルの免疫蛍光分析は、感染後27週で腸粘膜にサルモネラ菌が浸潤することを示しています。この画像では、核は青色に染色され、サルモネラ菌に感染した細胞は緑色で示されています。

対照群で示されているように、サルモネラ菌のコロニー形成がないことを示す明るい緑色の染色はありません。一方、感染後27週のサルモネラ菌に感染したマウスでは、腸粘膜に明るい緑色の染色が見られます。これは、ストレプトマイシン前処理マウスにおけるサルモネラ菌感染の持続性を示しています。

マウスモデルで一部の慢性感染を誘発する方法をお見せしました。この手順を実行するときは、ガレージ用に新しく文化を準備し、ガレージスキルを修正し、実験モデルが機能していることを確認するためにANAの存在を検出することを忘れないでください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。