Name: 慢性サルモネラ感染マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶ マウスを用いたSalmonella typhimurium慢性感染モデルの構築法。ストレプトマイシン前処理と胃管投与により、27週間持続する腸内定着を実現し、宿主細菌相互作用の長期的研究に応用可能です。

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細菌培養、マウスの強制経口投与、およびサルモネラの検出：このプロトコルは、次の3つの部分を含む。 1 サルモネラの成長条件。 <ol><li> 37℃で一晩インキュベートサルモネラ LB培地（LB）プレートを、準備します。 </li><li> LBプレートからクローンを選択し、12 mlチューブに7 mlのLBに入れ、そして37℃で約5時間振とうする。 </li><li>約18時間振盪せずに37℃で定常期の文化とインキュベート0.05 mlを50 mlのLBに接種する。 </li><li>比100:3（：HBSS LB）を使用して、HBSS中の細菌を一時停止、10分間6000rpmで室温で一晩細菌培養を回転させる。次に例を示します。 すべての50 mlのLB培養液を1.5mlのHBSSに懸濁される。 </li><li>動物の強制経口投与の場合は、さらに1:10の比で細菌培養を希釈する。次に例を示します。 毎1.5 mlのLB培養液を15mlのHBSSに懸濁される。 </li></ol> （2） サルモネラ感染症のモデル* <ol><li>ストレプトマイシン溶液を調製。各マウスは、100μlのHBSSでストレプトマイシンの7.5 mgを与えられます。例えば、10匹のマウスに対して1.2ミリリットルHBSSでストレプトマイシンの合計90mgのを準備。ストレプトマイシン溶液を調製する際は、必ずいくつかの余分なボリュームを持っている。 </li><li> 4時間強制経口投与、治療前に水と食料を撤回。 </li><li>ストレプトマイシン（対照マウスのためのHBSS100μlの）の7.5 mgのストレプトマイシンによる強制飼養マウス。ストレート食道を作るために人差し指で頭と首を伸ばし、しっかりと親指と中指でマウスの肩の皮膚をつかむ。口の屋根に沿ってと咽頭の背面の右側に向かって供給針のボールチップに指示、その後ゆっくりと食道に伝承し、100μlのソリューションを注入する。いいえ抵抗を感じてはいけません。 </li><li>ストレプトマイシンの治療、撤回水と食料20時間後でマウスが細菌に感染して再び前に。 </li><li> HBSS中の100μlの懸濁液と各マウスに強制経口投与または強制経口投与による滅菌HBSS（対照）で処理した。強制経口投与手順はストレプトマイシンと同じ）2.3などの強制経口投与したマウスです。 </li></ol> *動物実験は、以前は1で説明した6〜7週齢の特定病原体フリーの雌C57BL / 6マウス（タコニック、ハドソン、NY）を用いて行った。プロトコルは、動物資源上ロチェスター大学委員会の大学（UCAR）により承認された。 3。腸内のサルモネラの検出。 <ol><li> （約100mg）マウスは糞便収集する。 </li><li> 1ミリリットルPBSと激しくボルテックスの1.5マイクロ遠心チューブに糞便サンプルを転送します。 </li><li> 800回転で10分間遠心します。きれいな微量遠心チューブに上清を移す。 </li><li> 5分を6000rpmで遠心分離。上清を捨て、200μLのPBSでペレットに添加し、ボルテックスしています。 </li><li> サルモネラを検出するためにBBL CHROMagarプレート上に使い捨てセルスプレッダーとストリーク200μlのPBS。 サルモネラ種は、（紫にバラ、図1を参照）ふじ色が表示されます。プレート上に200μlの収量が多すぎるコロニー場合、100μlまたはストリークのための50μlを使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果。 プロトコルが正しく行われているときは、 ネズミチフス菌の保菌は、6ヶ月の上にマウスの腸内で検出することができます。 サルモネラは 6ヶ月（図1）を介して糞便培養によって検出される可能性がある。このモデルから来る典型的な外として、ボディは消失し、死は4週間、感染後内で発生する重量を量る。感染症に使用されるサルモネラの菌株に依存し、いくつかのマウスは6ヶ月にわたって生き残ることができる。 <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 サルモネラ種の腸内菌が原因選択した色原体の存在下で代謝の違いに、カラーで（紫にバラ）ふじ色が表示されます。他の細菌は、どちら抑制または青緑色や無色のコロニーを生成している。 <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 サルモネラ変異株PHOP C、PHOP Cに感染したマウスの生存割合アブラ-、およびPHOP C AvrA-/AvrA +、4週間（28日）のためのPHOP Cアブラ。 4週間のためのサルモネラに感染したマウスの表1。体重。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 </td><td> 1週間</td><td> 2週間</td><td> 3週間</td><td> 4週</td></tr><tr><td>の制御</td><td> 16.78 ± 1.05 </td><td> 16.91 ± 1.28 </td><td> 18.26 ± 1.23 </td><td> 19.31 ± 1.26 </td><td> 20.26 ± 1.15 </td></tr><tr><td> PHOP C </td> 16.89 ± 1.03 <td> 17.14 ± 1.19 </td><td> 17.43 ± 1.63 * </td><td> 18.68 ± 1.78 </td><td> 20.05 ± 1.11 </td></tr><tr><td> PHOP Cアブラ- </td><td> 16.91 ± 1.12 </td><td> 16.96 ± 1.39 </td><td> 17.06 ± 2.14 ** </td><td> 18.71 ± 2.18 </td><td> 20.15 ± 1.56 </td></tr><tr><td> PHOP C AvrA-/AvrA + </td><td> 16.94 ± 0.96 </td><td> 17.17 ± 1.02 </td><td> 17.63 ± 1.42 * </td><td> 18.44 ± 2.03 </td><td> 20.09 ± 1.17 </td></tr></tbody></table> *グループP &lt;0.05を制御するための比較 **グループP &lt;0.01を制御するための比較本研究で使用した表2。 サルモネラ菌株。 <table border="1"><tbody><tr><td>の名前</td><td>説明</td><td>参照またはソース</td></tr><tr><td> サルモネラ 14028s </td><td>野生型S.ネズミチフス菌 </td><td> ATCC </td></tr><tr><td> PHOP C </td><td>変異体の非病原性の複雑なレギュレータ</td><td> Millerら、1990 </td></tr><tr><td> PHOP Cアブラ- </td><td>アブラ-突然変異</td><td>コリアー-ハイアムズら、2002 </td></tr><tr><td> PHOP C AvrA-/AvrA + </td><td> PHOP C補完をコードするプラスミドのアブラアブラ付き</td><td>コリアー-ハイアムズら、2002 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このシステムを使用するには、それは、動物を強制経口投与する方法については、研究者のために必要です。我々は詳細細菌培養を準備し、マウスを強制経口投与するための方法論を。我々はまた、胃腸（GI）管におけるサルモネラの持続性を監視する方法を示します。を含めて、このプロトコルの重要なステップ： <ol><li>ストレプトマイシン前処理：ストレプトマイシン、前処理は、いくつかの共生腸内細菌叢を取り除くとサルモネラ感染症2に影響を受けやすいマウスを作ることができる。 </li><li> サルモネラ強制経口：初心者のために、強制経口投与が困難な場合があります。解決策が誤って気道に注入し、マウスの死亡を引き起こすされているのでいつか、強制経口投与は失敗します。 </li><li>永続的な細菌のコロニー形成：消化管での綿密なモニタリングの細菌を必要とする。マウス糞便培養に加えて、盲腸の内容は、BBL CHROMagarプレートのサルモネラの検出に使用することができます。マウスは、 サルモネラ感染症の後に犠牲にされているときに盲腸の内容を...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>LB培地</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>給餌針</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てセルスプレッダー</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性サルモネラ感染マウスモデル

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

細菌感染マウスモデルでは、感染症、炎症、免疫学、シグナル伝達、および腫瘍形成などの分野を研究するための強力なモデルシステムです。多くの研究者によって誘発される大腸炎の利用しています<em&gt;サルモネラ</em炎症と感染の初期段階における研究のための&gt;ネズミチフス。しかし、唯一の報告はほとんどの慢性感染症になります<em&gt; in vivoで</em&gt;。とマウス<em&gt;サルモネラ</em消化管の&gt;永続的な存在は、私たちは長期的なホスト - 細菌相互作用、シグナル伝達、および腫瘍形成を探索することができます。我々は、ある慢性細菌感染マウスモデルを確立している<em&gt;サルモネラ</em6ヶ月以上のマウスの腸内&gt;ネズミチフス菌のコロニー形成。このシステムを使用するには、それは細菌培養を準備し、動物を強制経口投与する方法については、研究者のために必要です。我々は詳細の準備細菌培養と強制経口投与したマウスのための方法論を。我々はまた、検出する方法を示しています。<em&gt;サルモネラ</em消化管に&gt;持続性。全体的に、このプロトコルは、根本的に重要な生物学的および微生物学的問題に対処するために細菌感染マウスモデルを用いて研究者を支援します。

持続的で慢性細菌感染マウスモデルを確立する<em&gt;サルモネラ</em27週のための腸内で&gt;ネズミチフス菌のコロニー形成。

細菌感染マウスモデルは、感染、炎症、免疫学、シグナル伝達などの分野を研究するための強力なモデルシステムであり、...

この手順の全体的な目的は、慢性サルモネラ感染マウスモデルを確立することです。まず、サルモネラ溶液を調製します。次に、マウスにストレプトマイシンを経口投与し、続いてサルモネラを投与するか、あるいはストレプトマイシンのみを投与します。本手順の第3ステップでは、マウスの糞便からサルモネラを分離し、BLクロマプレートを用いてマウス腸管内でのサルモネラ感染を検出します。最終ステップでは、マウスの体重を観察・記録し、サルモネラ感染後の活力の変化を確認します。最終的に、サルモネラを経口投与したマウスの腸管において、サルモネラ感染が成立することが示されます。こんにちは。私はロチェスター大学医学部のJohnson博士の研究室のMichelle Pです。また、Sun Labからも参加しております。私はSun LabのYです。本日は、Alytic Lennar感染マウスモデルの作製手順について説明します。当研究室では、宿主と細菌の相互作用におけるシグナル伝達および腫瘍形成を研究するために本手順を用いています。それでは、始めていきましょう。実験を開始する前に、各サルモネラ菌株および実験全体を通して使用するのに十分な量のLuria-Bertani（LB）液体培地またはLB寒天培地プレートを準備してください。プレートは冷蔵して数ヶ月間保存可能です。次に、サルモネラ培養液を準備します。−80 °Cで凍結保存されたサルモネラのストックバイアルを取り出し、室温で解凍してサルモネラをプレートに塗布します。白金線路をバーナーで火炎滅菌し、解凍した細菌ストックに浸します。LBプレートの上部3分の1の範囲で、白金線をジグザグに往復させて塗布します。再度白金線を火炎滅菌し、プレートを回転させます。ループをジグザグに動かして前の画線と交差させ、プレートの2分の1から3分の2の領域に細菌を広げます。これをもう一度繰り返します。その後、再度ループを火炎滅菌します。ループがアガーに突き刺さらないようにしてください。プレートを37°Cのインキュベーターに一晩保存し、コロニーを成長させます。正しく行われていれば、サルモネラプレートの少なくとも1つのセクションに単一コロニーが形成されます。翌日。滅菌済みのつまようじまたは白金線を用いてLBプレートからクローンをピックアップし、12 mLチューブに入れた7 mLのLB培地に加えます。チューブを37 °Cで約5時間振盪します。この培養液を0.05 milliliters使用し、Falconチューブに入れた50 millilitersのLBに接種します。37 °Cで、振盪せずに約18時間インキュベートします。50 mLの細菌 overnight培養液を室温、5,000 RPMで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。次に、細菌を再懸濁させるため、チューブに1.5 mLのハン

Research

JoVE Journal

Biology

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