Name: アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 学ぶアプタマー選択法を用いたアミロイドβ-蛋白質に特異的に結合するRNA分子のin vitro選択手法。この技術はアルツハイマー病の診断と治療への応用可能性を示している。

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この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からNIH / NIAと07から65798からの補助金AG030709によってサポートされていました。我々は、サポートおよび試薬を提供するためのペプチドの合成とアミノ酸分析のためのマーガレットM.コンドロン、プロジェクトの最初のステップを支援し、サポートするための博士エリザベスF.ニューフェルド、博士カイ香港B.チェンを認識し、博士とアンドリューD有用な議論のため。エリントン。

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<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
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利害の衝突は宣言されません。

SELEXプロセスの出発点は、通常、10 12 -10 15配列を含む、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの合成です。 RNA SELEXで、ここに示したのに対し、DNA SELEXでは、このライブラリは、ssDNAのプールが生成された後に直接使用され、ssDNAのライブラリは、 インビトロ転写によって酵素的にRNAのプールに最初に変換されます。各サイクルが曝露と目的のターゲットへのオリゴヌクレオチドの結合を含み、それによってその後、SELEXは、非結合配列、および結合配列の溶出からバインダーの仕切りを、繰り返し実行されます。後のサイクルでは、標的RNAおよび/または洗浄の数の化学量論を変更することができる、または競合的阻害剤は、SELEX条件のストリンジェンシーを高めるために結合または洗浄バッファーに追加することができます。多数の方法が結合し、パーティショニングのために28を記載されているのにフィルタの結合は、SELEX 10用に使われる古典的な、シンプルで、迅速な方法です。フィルター結合は溶液中のRNA -ターゲットの相互...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA バイオポリマー研究室</td><td></td><td>凍結乾燥粉末</td></tr><tr><td>MX5 Automated-S マイクロバランス</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンコーティング済み1.6 mlチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033またはC19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>ドラフトチャンバー内で使用してください。</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスにかける。APSは使用するたびに調製し、48時間以内に使用すること。</td></tr><tr><td>トリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II) 六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスしてください。周囲の光から試薬を保護するため、RuBpyチューブをアルミホイルで覆います。RuBpyは毎回調製し、48時間以内に使用してください。</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; 脱塩カラム</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>シリコンコーティング済み0.6mlチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine ゲル (10%&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10ウェル；ミニサイズ（8 cm X 8 cm）；25 &amp;#x03BC;ウェルあたりのロード量；分離範囲 5 kDa〜40 kDa</td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 分光光度計</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNAライブラリ</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタムオーダーの</td><td>このライブラリは、プライマー結合部位およびクローニング部位を含む2つの定常領域に挟まれた49個のランダムヌクレオチドを含むように設計されており、5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>組換え &lt;電子顕微鏡&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; 10（単位）で供給されるDNAポリメラーゼ&amp;#215; PCRバッファーおよび25 mM MgCl2の別チューブ&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ルーチンPCR用。</td></tr><tr><td>PCRヌクレオチドミックス、10 mM溶液</td><td>USB Corp.、Affymetrix</td><td>77212</td><td>(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各10 mM)</td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>特注の</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタムオーダーの</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Oリング付きキャップ付きの滅菌済み1.6-mlコニカルチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; 大規模RNA製造システム&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>キットの内容：120 &amp;#x03BC;酵素ミックス（RNAポリメラーゼ、組換えRNasin）&amp;#174; リボヌクレアーゼ阻害剤および組換え無機ピロホスファターゼ）；240 &amp;#x03BC;転写バッファー 5; 100 &amp;#x03BC;4種類のrNTP（各100 mM）、RQ1 RNaseフリーDNase（110 U）、1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;リニアコントロールDNA（1 mg/ml）、3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）1 ml、ヌクレアーゼフリー水 1.25 ml</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-シチジン 5&amp;rsquo;-トリリン酸, 250 &amp;mu;Ci (9.25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>比放射能：3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)</td></tr><tr><td>クエン酸飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (125:24:1, pH 4.7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム：イソアミルアルコール (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用絶対エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK 冷蔵マイクロ遠心機</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 マイクロカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>Fisher Scientific (45-001-487)より購入</td><td>Sephadex充填済み&amp;#8482; G-50 DNA Gradeを使用し、殺生物剤として0.15% Kathonを含むSTEバッファーで事前平衡化した。</td></tr><tr><td>Triathlerベンチトップ型シンチレーションカウンタ</td><td>Hidex Oy, フィンランド、トゥルク</td><td>Triathler LSC モデル: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-尿素サンプルバッファー（2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-尿素ゲル 1.0 mm、10ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE電泳バッファー (5X)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>放射能除染剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングチップ</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;電子顕微鏡（EM）&gt;SureLock&lt;/em&gt; ミニセル</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;電子顕微鏡（EM）&gt;SureLock&lt;/em&gt; ミニセル</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーフィルム</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>完全な暗所で使用すること</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィー用フィルム、Hyperfilm&amp;#8482; 電気化学発光（ECL）</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>レッドセーフライト（赤色安全光）下で使用可能です。</td></tr><tr><td>メンブレンディスク</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>混合セルロースエステル、親水性、0.22-&amp;#x03BC;m-disc メンブレン</td></tr><tr><td>125mlフラスコ用ガラスフリット支持台</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>組換え型RNaseインヒビター</td><td>USB Corp.、Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;逆転写システム</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>組換えRNase阻害剤</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; ローディングダイ</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

アルツハイマー病（AD）は1、その発症前診断が困難なレンダリング狡猾なコースを持つプログレッシブ、年齢依存性、神経変性疾患である。明確なADの診断は、このように、ADの発症前、早期診断が効果的な治療法2,3の開発と管理のための非常に重要である確立する、唯一の事後分析を実現しています。 アミロイドβ-蛋白質は（Aβ）ADの病因の中心です。水溶性、オリゴマーAβアセンブリはAD 4,5におけるシナプス機能障害とニューロンの損失の基礎となる神経毒性に影響を及ぼすと考えられている。可溶性Aβアセンブリの様々な形態が記載されている、しかし、それらの相互関係と、ADの病因および病因に関連性は複雑で、ウェル6理解されていない。症状が現れる前に、特定の分子認識ツールでは、Aβアセンブリ間の関係を解明し、疾患の過程で早期にこれらのアセンブリの検出と特徴付けを促進することができる。分子認識は、一般的に抗体に依存しています。しかし、分子認識ツールの代替クラス、アプタマーは、抗体7,8の相対重要な利点を提供しています。指数関数的濃縮（SELEX）9,10によるリガンドの系統進化：アプタマーは、 試験管内の選択によって生成されたオリゴヌクレオチドである。 SELEXは、ダーウィンの進化論に似て、可能にする、という反復的なプロセスであり、選択、増幅、濃縮、およびプロパティの永続化、など、熱心な、特定の、リガンド結合（アプタマー）または触媒活性（リボザイムとDNAzymes）。 現代のバイオテクノロジーと医学11のツールとしてのアプタマーの出現にもかかわらず、彼らはアミロイドの分野で十分に活用されています。いくつかのRNAまたはssDNAのアプタマーは、プリオン蛋白質（プリオン）12月16日の様々な形態に対して選択されています。組換えウシのPrPに対して生成されたRNAアプタマーは、アミロイド線維の18を形成する完全長のPrPの水溶性、オリゴマー、β-シートが豊富な立体配座の変異型、ウシのPrP -β17を認識することが示された。アプタマーは、線維のβ2 -ミクログロブリン（β2 m）の単量体といくつかの形式を使用して生成されたβ2メートルフィブリル19に加えて、特定の他のアミロイドタンパク質の線維を結合することが見出された。 Ylera ら 。固定化単量体のAβ4020に対して選択されたRNAアプタマーを説明した。不意に、これらのアプタマーは、線維Aβ40をバインド。完全に、これらのデータはいくつかの重要な問題を提起する。なぜ単量体のタンパク質に対して選択されたアプタマーは、それらのポリマー形態を認識するのですか？アミロイド生成性タンパク質の単量体及び/またはオリゴマーの形態に対するアプタマーが得られるか？これらの質問に対処するために、我々は、光誘起架橋無修正のタンパク質（PICUP）22,23を使用して生成された共有結合で安定化オリゴマーAβ4021のアプタマーを選択することを試みた。前回の調査結果17,19,20と同様に、これらのアプタマーは、おそらく構造aptatope 21潜在的に共通のアミロイドを認識Aβおよび他のいくつかのアミロイド蛋白質の線維と反応した。ここで、我々は、これらのアプタマー21の製造に使用されるSELEX方法論を提示する。

アプタマーは、で選択された短いribo-/deoxyribo-oligonucleotidesです<em&gt;体外</em&gt;特定のターゲットの親和性に基づく進化の方法。アプタマーは、多目的な治療、診断、および研究アプリケーションとの分子認識ツールです。我々は、アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択のための方法を示しています。

アルツハイマー病（AD）は、進行性の加齢依存性神経変性疾患であり、その経過は潜行性であるため、発症前の診断が困難である...

RNA Selectsにおける選択実験の全体的な目的は、標的タンパク質に特異的かつ強力に結合するRNA分子を選択することです。これは、ランダムなDNAオリゴヌクレオチドライブラリーからRNAをin vitro転写し、得られた転写RNAプールを標的タンパク質とともにインキュベートすることで達成されます。第二のステップとして、フィルター結合法が用いられます。これにより、標的結合RNA分子を非結合RNAプールから分離します。次に、標的結合RNA分子を回収し、逆転写してDNAにした後、PCRで増幅させ、再びRNAへと転写します。いくつかの結合能力を持つ分子が濃縮されたこのRNAプールは、次回の選択サイクルで標的に結合させるために使用されます。通常、8回から20回のサイクルを経て、標的に対して非常に高い親和性を持つ標的特異的アプタマーが選択され、特性評価されます。こんにちは、UCLA神経科学科のガル・ビーンです。今日はファラ・ラヒミと共に解説します。私の研究室のシニアポストドクターが、Cellexと呼ばれる手法の実演を行います。当研究室では、アミロイドβオリゴマーに対する抗体を選別するためにこの手法を用いてきました。それでは始めましょう。それでは、解説に移ります。本実験では、アミロイドβタンパク質Aβ40からなる、均質で凝集のない安定したタンパク質リガメントを調製します。調製には、以前のJoVEビデオプロトコルで説明された手順を用い、付属の書面プロトコルに詳述されている修正を加えます。架橋後、5 mL脱塩カラムを用いて架橋リガメント混合物を精製します。まず、カラムをスタンドに設置し、カラム出口の下にビーカーを置きます。カラムの上部キャップと出口プラグを取り外します。保存バッファーを流し、それをビーカーに回収します。次に、10 millimolar 酢酸アンモニウム (pH 8.3) を3 mLずつ5回分流し、カラムを平衡化します。カラムの平衡化後、ピックアップ反応混合液 0.5 mLをカラムに適用します。タンパク質混合液をレジンに浸透させ、通り抜けた液（フロースルー）を廃棄します。ビーカー内のカラム出口の下に、1本目の回収チューブを配置します。カラムに0.5 millilitersの酢酸バッファーを加え、最初に流出した0.5 milliliterの画分を回収します。この溶出操作を繰り返し、対応するチューブに計8.5 milliliterの画分を回収します。サンプルをSDS-PAGEおよび吸光度で特性評価します。タンパク質含有量が最も高い分画を合わせ、書面によるプロトコルに従ってピペットで緩やかに混合します。アミノ酸分析用に10 µLの分注液を確保し、残りを保存します。次に、RNAプールを調製します。まず、付属の書面プロトコルに従い、PCRによって合成一本鎖DNAライブ

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神経科学

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS -...

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

原子間力顕微鏡とバイオパニング技術を組み合わせて、低濃度であってもあらゆる生物学的材料に存在する疾患特異的タンパク質変異体に対する抗体を取得するためのネガティブおよびポジティブバイオパニングシステムを作成しました。...

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

細胞表面タンパク質の輸送を比較的容易に研究されているが、細胞内タンパク質の輸送を可視化することははるかに困難です。ここでは、光活性化GFPを組み込んだコンストラクトを使用して、正確にダウンストリームの区画にゴルジ体からのアミロイド前駆体タンパク質に従い、その隙間に従うようにする方法を実証します。...

光活性化GFPでAPPの細胞内輸送をイメージング

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。...

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。...

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β...

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI 分子研) 分子イメージングは、生体試料中の複数検体の同時マッピングをことができます。ここでは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー サンプル MALDI IMS を使用しての脳組織のアミロイド β タンパク質の可視化と検出のためのプロトコルを提案する.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。...

マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。...

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

ここでは、ヒトγ-セクレターゼを再構成する酵母系について述べる。このシステムにより、活性に影響を与える突然変異の同定と研究、およびγ-セクレターゼ阻害剤(GSI)のスクリーニングが可能になります。家族性アルツハイマー病変異体の機能喪失特性を利用して、γ-セクレターゼモジュレーター(GSM)のスクリーニングが可能です。...

出芽酵母 γ-セクレターゼによるアミロイドベーターゼ産生に影響を与える遺伝子、突然変異、および化学物質をスクリーニングするためのアルツハイマー病のモデル

学ぶアプタマー選択法を用いたアミロイドβ-蛋白質に特異的に結合するRNA分子のin vitro選択手法。この技術はアルツハイマー病の診断と治療への応用可能性を示している。

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

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