Name: アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 学ぶアプタマー選択法を用いたアミロイドβ-蛋白質に特異的に結合するRNA分子のin vitro選択手法。この技術はアルツハイマー病の診断と治療への応用可能性を示している。

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この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からNIH / NIAと07から65798からの補助金AG030709によってサポートされていました。我々は、サポートおよび試薬を提供するためのペプチドの合成とアミノ酸分析のためのマーガレットM.コンドロン、プロジェクトの最初のステップを支援し、サポートするための博士エリザベスF.ニューフェルド、博士カイ香港B.チェンを認識し、博士とアンドリューD有用な議論のため。エリントン。

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<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
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利害の衝突は宣言されません。

SELEXプロセスの出発点は、通常、10 12 -10 15配列を含む、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの合成です。 RNA SELEXで、ここに示したのに対し、DNA SELEXでは、このライブラリは、ssDNAのプールが生成された後に直接使用され、ssDNAのライブラリは、 インビトロ転写によって酵素的にRNAのプールに最初に変換されます。各サイクルが曝露と目的のターゲットへのオリゴヌクレオチドの結合を含み、それによってその後、SELEXは、非結合配列、および結合配列の溶出からバインダーの仕切りを、繰り返し実行されます。後のサイクルでは、標的RNAおよび/または洗浄の数の化学量論を変更することができる、または競合的阻害剤は、SELEX条件のストリンジェンシーを高めるために結合または洗浄バッファーに追加することができます。多数の方法が結合し、パーティショニングのために28を記載されているのにフィルタの結合は、SELEX 10用に使われる古典的な、シンプルで、迅速な方法です。フィルター結合は溶液中のRNA -ターゲットの相互...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA バイオポリマー研究室</td><td></td><td>凍結乾燥粉末</td></tr><tr><td>MX5 Automated-S マイクロバランス</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンコーティング済み1.6 mlチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033またはC19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>ドラフトチャンバー内で使用してください。</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスにかける。APSは使用するたびに調製し、48時間以内に使用すること。</td></tr><tr><td>トリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II) 六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>溶液が透明になるまでボルテックスしてください。周囲の光から試薬を保護するため、RuBpyチューブをアルミホイルで覆います。RuBpyは毎回調製し、48時間以内に使用してください。</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; 脱塩カラム</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>シリコンコーティング済み0.6mlチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine ゲル (10%&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10ウェル；ミニサイズ（8 cm X 8 cm）；25 &amp;#x03BC;ウェルあたりのロード量；分離範囲 5 kDa〜40 kDa</td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 分光光度計</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNAライブラリ</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタムオーダーの</td><td>このライブラリは、プライマー結合部位およびクローニング部位を含む2つの定常領域に挟まれた49個のランダムヌクレオチドを含むように設計されており、5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>組換え &lt;電子顕微鏡&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; 10（単位）で供給されるDNAポリメラーゼ&amp;#215; PCRバッファーおよび25 mM MgCl2の別チューブ&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ルーチンPCR用。</td></tr><tr><td>PCRヌクレオチドミックス、10 mM溶液</td><td>USB Corp.、Affymetrix</td><td>77212</td><td>(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各10 mM)</td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>特注の</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタムオーダーの</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Oリング付きキャップ付きの滅菌済み1.6-mlコニカルチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; 大規模RNA製造システム&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>キットの内容：120 &amp;#x03BC;酵素ミックス（RNAポリメラーゼ、組換えRNasin）&amp;#174; リボヌクレアーゼ阻害剤および組換え無機ピロホスファターゼ）；240 &amp;#x03BC;転写バッファー 5; 100 &amp;#x03BC;4種類のrNTP（各100 mM）、RQ1 RNaseフリーDNase（110 U）、1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;リニアコントロールDNA（1 mg/ml）、3M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）1 ml、ヌクレアーゼフリー水 1.25 ml</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-シチジン 5&amp;rsquo;-トリリン酸, 250 &amp;mu;Ci (9.25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>比放射能：3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)</td></tr><tr><td>クエン酸飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (125:24:1, pH 4.7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム：イソアミルアルコール (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用絶対エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK 冷蔵マイクロ遠心機</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 マイクロカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>Fisher Scientific (45-001-487)より購入</td><td>Sephadex充填済み&amp;#8482; G-50 DNA Gradeを使用し、殺生物剤として0.15% Kathonを含むSTEバッファーで事前平衡化した。</td></tr><tr><td>Triathlerベンチトップ型シンチレーションカウンタ</td><td>Hidex Oy, フィンランド、トゥルク</td><td>Triathler LSC モデル: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-尿素サンプルバッファー（2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-尿素ゲル 1.0 mm、10ウェル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE電泳バッファー (5X)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>放射能除染剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングチップ</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;電子顕微鏡（EM）&gt;SureLock&lt;/em&gt; ミニセル</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;電子顕微鏡（EM）&gt;SureLock&lt;/em&gt; ミニセル</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーフィルム</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>完全な暗所で使用すること</td></tr><tr><td>オートラジオグラフィー用フィルム、Hyperfilm&amp;#8482; 電気化学発光（ECL）</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>レッドセーフライト（赤色安全光）下で使用可能です。</td></tr><tr><td>メンブレンディスク</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>混合セルロースエステル、親水性、0.22-&amp;#x03BC;m-disc メンブレン</td></tr><tr><td>125mlフラスコ用ガラスフリット支持台</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>組換え型RNaseインヒビター</td><td>USB Corp.、Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;逆転写システム</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>組換えRNase阻害剤</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; ローディングダイ</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

アルツハイマー病（AD）は1、その発症前診断が困難なレンダリング狡猾なコースを持つプログレッシブ、年齢依存性、神経変性疾患である。明確なADの診断は、このように、ADの発症前、早期診断が効果的な治療法2,3の開発と管理のための非常に重要である確立する、唯一の事後分析を実現しています。 アミロイドβ-蛋白質は（Aβ）ADの病因の中心です。水溶性、オリゴマーAβアセンブリはAD 4,5におけるシナプス機能障害とニューロンの損失の基礎となる神経毒性に影響を及ぼすと考えられている。可溶性Aβアセンブリの様々な形態が記載されている、しかし、それらの相互関係と、ADの病因および病因に関連性は複雑で、ウェル6理解されていない。症状が現れる前に、特定の分子認識ツールでは、Aβアセンブリ間の関係を解明し、疾患の過程で早期にこれらのアセンブリの検出と特徴付けを促進することができる。分子認識は、一般的に抗体に依存しています。しかし、分子認識ツールの代替クラス、アプタマーは、抗体7,8の相対重要な利点を提供しています。指数関数的濃縮（SELEX）9,10によるリガンドの系統進化：アプタマーは、 試験管内の選択によって生成されたオリゴヌクレオチドである。 SELEXは、ダーウィンの進化論に似て、可能にする、という反復的なプロセスであり、選択、増幅、濃縮、およびプロパティの永続化、など、熱心な、特定の、リガンド結合（アプタマー）または触媒活性（リボザイムとDNAzymes）。 現代のバイオテクノロジーと医学11のツールとしてのアプタマーの出現にもかかわらず、彼らはアミロイドの分野で十分に活用されています。いくつかのRNAまたはssDNAのアプタマーは、プリオン蛋白質（プリオン）12月16日の様々な形態に対して選択されています。組換えウシのPrPに対して生成されたRNAアプタマーは、アミロイド線維の18を形成する完全長のPrPの水溶性、オリゴマー、β-シートが豊富な立体配座の変異型、ウシのPrP -β17を認識することが示された。アプタマーは、線維のβ2 -ミクログロブリン（β2 m）の単量体といくつかの形式を使用して生成されたβ2メートルフィブリル19に加えて、特定の他のアミロイドタンパク質の線維を結合することが見出された。 Ylera ら 。固定化単量体のAβ4020に対して選択されたRNAアプタマーを説明した。不意に、これらのアプタマーは、線維Aβ40をバインド。完全に、これらのデータはいくつかの重要な問題を提起する。なぜ単量体のタンパク質に対して選択されたアプタマーは、それらのポリマー形態を認識するのですか？アミロイド生成性タンパク質の単量体及び/またはオリゴマーの形態に対するアプタマーが得られるか？これらの質問に対処するために、我々は、光誘起架橋無修正のタンパク質（PICUP）22,23を使用して生成された共有結合で安定化オリゴマーAβ4021のアプタマーを選択することを試みた。前回の調査結果17,19,20と同様に、これらのアプタマーは、おそらく構造aptatope 21潜在的に共通のアミロイドを認識Aβおよび他のいくつかのアミロイド蛋白質の線維と反応した。ここで、我々は、これらのアプタマー21の製造に使用されるSELEX方法論を提示する。

アプタマーは、で選択された短いribo-/deoxyribo-oligonucleotidesです<em&gt;体外</em&gt;特定のターゲットの親和性に基づく進化の方法。アプタマーは、多目的な治療、診断、および研究アプリケーションとの分子認識ツールです。我々は、アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択のための方法を示しています。

アルツハイマー病（AD）は、進行性の加齢依存性神経変性疾患であり、その経過は潜行性であるため、発症前の診断が困難である...

RNA Selectsにおける選択実験の全体的な目的は、標的タンパク質に特異的かつ強力に結合するRNA分子を選択することです。これは、ランダムなDNAオリゴヌクレオチドライブラリーからRNAをin vitro転写し、得られた転写RNAプールを標的タンパク質とともにインキュベートすることで達成されます。第二のステップとして、フィルター結合法が用いられます。これにより、標的結合RNA分子を非結合RNAプールから分離します。次に、標的結合RNA分子を回収し、逆転写してDNAにした後、PCRで増幅させ、再びRNAへと転写します。いくつかの結合能力を持つ分子が濃縮されたこのRNAプールは、次回の選択サイクルで標的に結合させるために使用されます。通常、8回から20回のサイクルを経て、標的に対して非常に高い親和性を持つ標的特異的アプタマーが選択され、特性評価されます。こんにちは、UCLA神経科学科のガル・ビーンです。今日はファラ・ラヒミと共に解説します。私の研究室のシニアポストドクターが、Cellexと呼ばれる手法の実演を行います。当研究室では、アミロイドβオリゴマーに対する抗体を選別するためにこの手法を用いてきました。それでは始めましょう。それでは、解説に移ります。本実験では、アミロイドβタンパク質Aβ40からなる、均質で凝集のない安定したタンパク質リガメントを調製します。調製には、以前のJoVEビデオプロトコルで説明された手順を用い、付属の書面プロトコルに詳述されている修正を加えます。架橋後、5 mL脱塩カラムを用いて架橋リガメント混合物を精製します。まず、カラムをスタンドに設置し、カラム出口の下にビーカーを置きます。カラムの上部キャップと出口プラグを取り外します。保存バッファーを流し、それをビーカーに回収します。次に、10 millimolar 酢酸アンモニウム (pH 8.3) を3 mLずつ5回分流し、カラムを平衡化します。カラムの平衡化後、ピックアップ反応混合液 0.5 mLをカラムに適用します。タンパク質混合液をレジンに浸透させ、通り抜けた液（フロースルー）を廃棄します。ビーカー内のカラム出口の下に、1本目の回収チューブを配置します。カラムに0.5 millilitersの酢酸バッファーを加え、最初に流出した0.5 milliliterの画分を回収します。この溶出操作を繰り返し、対応するチューブに計8.5 milliliterの画分を回収します。サンプルをSDS-PAGEおよび吸光度で特性評価します。タンパク質含有量が最も高い分画を合わせ、書面によるプロトコルに従ってピペットで緩やかに混合します。アミノ酸分析用に10 µLの分注液を確保し、残りを保存します。次に、RNAプールを調製します。まず、付属の書面プロトコルに従い、PCRによって合成一本鎖DNAライブラリを増幅させます。増幅したDNA産物を精製し、2%アガロースゲル電気泳動によってDNA量を検証します。一般的に、DNAの濃度および収量は、1本あたり50マイクロリットルの液量で160±10ナノグラム/マイクロリットルとなります。次に、放射性CTPの存在下でDNAを一夜かけてインビトロ転写し、続いて、付属の書面プロトコルに詳述されている通り、増幅させたDNAテンプレートをDNaseで4時間消化し、P32標識RNAプールを調製します。メーカーのPromega社はDNaseによる15分間のインキュベーションを推奨していますが、我々の実験では、DNaseで4時間インキュベートすることで、すべてのDNAテンプレートを完全に除去できることが分かりました。クエン酸飽和フェニルクロロホルムおよびイソアミルアルコールを1容量分加え、約1分間ボルテックスした後、室温で16,000 Gsで2分間遠心分離してRNAを抽出する。遠心分離後、上層の水相を新しいチューブに移す。マイクロピペットを用いてクロロホルム・イソアミルアルコールを1容量分加え、1分間ボルテックスし、遠心分離を行う。前と同様に、マイクロピペットで吸引して下層を取り除く。このステップでは、上層よりも下層を除去する方が容易であることに注意してください。下層は廃棄します。次に、RNAを沈殿させるため、3 M 酢酸ナトリウムを0.1容量分、イソプロパノールを1容量分加えます。混合し、-20 °Cのフリーザーで15分間静置します。15分後、遠心分離を行い上清を吸引除去し、RNAペレットを0.5 mLの70% ethanolで洗浄します。エタノールで洗浄した後、遠心分離を行い、エタノールを廃棄します。加熱ブロックを用いてRNAペレットを37 °Cで5分間乾燥させ、in vitro転写反応と同じ容量になるように、RNAサンプルを150 mM STE buffer pH 8.0に溶解します。RNA産物を含むチューブをヒーティングブロックを用いて70 °Cで10分間加熱し、ボルテックスします。RNAの溶解を促進するため、室温で最高速度で1分間遠心分離します。シンチレーション計数およびTPE尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動用に、1 µLのRNAを分注して保存してください。RNAの溶解後、製造者の指示に従い、G 50カラムを用いて未反応のヌクレオチドを除去します。シンチレーション計数および変性ゲル電気泳動用に、G 50精製RNAを1 µL分取しておくことを忘れないでください。シンチレーション計数には、RNA沈殿およびG 50脱塩ステップで得られた2つの1 µLのRNA分注液を使用します。シンチレーション計数後に標識取り込み率を算出し、その取り込み率に基づき、RNAの収量および比活性を算出してください。最後に、サンプルを6% TBE ureaポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、付属の書面プロトコルに記載されている方法でオートラジオグラフィーによりRNAを可視化することで、G 50精製前後のRNAを検討します。標識産物の品質に満足した場合は、RNAライブラリーをタンパク質サンプルと混合し、セレクションに進みます。RNAストックを90 °Cで10分間インキュベートして変性させ、その後、室温で10分間インキュベートして緩徐に再自然化させます。RNAをインキュベートしている間に、タンパク質チューブ1本分を8 µLの60 mM 水酸化ナトリウムと36 µLの核酸フリー脱イオン水に溶解させます。混合物を1分間ソニケーションし、36 µLの2X RNA結合バッファーを加えます。陰性対照については以下の通りです。RNAに10 X RNA結合バッファー 20 µLを加え、ヌクレアーゼフリーウォーターで全量を200 µLにします。結合反応には、タンパク質とRNAの混合液 20 µLに10 X RNA結合バッファー 20 µLを加え、ヌクレアーゼフリーウォーターで全量を200 µLにします。チューブを室温で30分間インキュベートします。その間に、サンプルをインキュベートしながら、フィルターおよびフィルターバインディングセットの準備を行います。まず、125 milliliterのサイドアームフラスコを真空導入口に取り付けます。サイドアームフラスコの上に、あらかじめ洗浄したフィルター用多孔質ガラスサポートを設置します。次に、35×10 mmのペトリ皿内で、3枚のフィルターメンブレンを1X RNA結合バッファー2～3 mLに10～15分間浸し、平衡化させます。陰性対照および結合反応サンプルのインキュベーションが完了したら、最高速度で5分間遠心分離します。室温にて、バキュームを作動させ、1枚目のメンブレンを多孔質ガラス上に配置し、マイクロピペットを用いてRNA結合バッファー0.5 mLをメンブレン上に滴下します。各バッファーの液滴がメンブレンをゆっくりと通過するように真空度を調整します。この最初のフィルターは、真空吸引の調整にのみ使用します。次に、2枚目のメンブレンを多孔質ガラスの上に置き、同じ流速で、ネガティブコントロールをメンブレンに適用します。サンプルを適用した後、1×RNA結合バッファー0.5 milliliter分を用いて4回洗浄します。ネガティブコントロールのメンブレンを取り出し、シンチレーション計数用のチューブに入れます。多孔質ガラスを、あらかじめ洗浄した2枚目の多孔質ガラスサポートに交換します。3枚目のディスクを多孔質ガラスの上に置き、結合反応混合液を加えてください。先ほど示したようにフィルターを洗浄します。後の選択サイクルでは、洗浄回数を増やすことができます。選択条件のストリンジェンシーを高めるには、フィルターディスクを取り出し、「binding reaction」とラベルを貼った1.6 milliliterチューブに入れます。両方のフィルターについてシンチレーション計数を行います。メンブレンに適用した放射能の総量に対する、フィルター結合放射能の割合を算出します。これにより、セレクションの進行に伴う結合濃縮の指標が得られます。シンチレーション計測後、結合反応フィルターをチューブから取り出し、清潔で乾燥した35×10 mmのペトリ皿に置きます。清潔なメスとピンセットを使用して、メンブレンを小さく裁断します。ピンセットを用いて、裁断した断片をシンチレーションバイアルに戻します。400 µLの溶出バッファーを加え、チューブを95 °Cで10分間インキュベートします。10分後、ボルテックスで混合し、室温で最高速度にて遠心分離を行い、抽出バッファーを吸引してラベル付きの新しいチューブに回収します。メンブレン片が入ったチューブに残っている放射能カウントをシンチレーション計数により測定します。抽出効率を評価するため、抽出を3回繰り返します。3回抽出後の効率は通常約95〜96%になります。次に、RNA共沈剤として3〜4 µLのグリコーゲンを加え、前述の方法に従ってフィルターから放出されたRNAを抽出し沈殿させますが、その際、-20 °Cのフリーザーに一晩保存してください。一晩のインキュベーション後、サンプルを遠心分離すると、RNAがわずかにしか見えない液相へと沈殿します。チューブ底部にあるこの視認困難な沈殿相を乱さないよう、上清を注意深く吸引してください。RNAペレットを0.5 millilitersの70%ethanolで洗浄し、4 °Cで最高速度にて5分間遠心分離し、視認困難な沈殿相を乱さないようにエタノールを吸引して除去します。RNAペレットを50 µLのSTEバッファーに溶解し、付属の書面プロトコルで新規転写RNAについて説明されているG 50精製を行います。次の選択サイクルに進むには、付属の書面プロトコルに従い、RNAをDNAに逆転写し、続いてPCR増幅を行います。逆転写酵素を除いたネガティブコントロールサンプルを含めることを忘れないでください。PCR産物をゲルで確認し、陰性対照のレーンにバンドがなく、他のレーンが期待通りであることを確認します。前述の手順に従ってRNAの転写およびラベル化を行い、使用可能な状態にします。次のサイクルでは、生成されたオリゴマーを回収します。選択に使用したAβ40タンパク質は、本ビデオプロトコルに示した方法で精製し、赤色のトレースで示す吸光度測定およびSDS-PAGEを用いて解析しました。タンパク質は一貫してフラクション3から5にかけてカラムから溶出され、架橋剤はフラクション6以降に溶出しており、これはフラクション7の吸光度上昇によって示されています。SDS-PAGEでは、典型的なAβ40オリゴマーの分布が確認されました。各選択サイクルにおいてRNAの完全性を維持することは、反復的な選択プロセスを進行させる上で重要です。RNAの転写および標識後、標識RNAの品質を変性ゲル電気泳動によって評価します。以下は、G 50精製前後の完全な標識RNA産物の典型的なプロファイルです。in vitro転写反応後に前回の選択サイクルから由来する鋳型DNAが混入したままだと、選択効率が低下し、より多くのサイクルが必要になる可能性があります。逆転写反応後のアガロースゲル電気泳動およびそれに続くPCR増幅により、期待されるDNA産物が確認されます。陰性対照反応チューブにDNA産物が見られないことは、in vitro転写後のDNA処理によってDNAテンプレートが正常に除去されたことを示しています。以上で、光架橋により共有結合で安定化させたアミロイドβ40オリゴマーに対する抗体の選択方法について説明しました。この手順を行う際は、高い親和性を得るためには両方の分子が安定した構造を持っている必要があること、また、両者が相互作用する三次元構造を有していることを念頭に置くことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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