Name: 胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶマウス胚盤胞から栄養膜幹細胞を導出する方法。フィーダー細胞を用いた培養と分化誘導の技術を習得し、胎盤発生の研究に応用する基礎的な手法を理解できます。

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著者は、元のプロトコルのためにジャネットRossantに感謝。本研究では、WHの保健助成金CA106308の国立研究所によってサポートされていました。

このプロトコルでは、我々はマウス胚盤胞とTS細胞の樹立の準備について説明します。自然交配と超排卵の誘導のために設定を含む事前の胚盤胞のコレクションへの一般的なマウス操作では、、基本的にはナギらによって示される標準のプロトコルに従ってください。2003（pp146 - 150）。 TS細胞の派生とメンテナンス<ol><li>興味のマウスとの間のセットアップの繁殖クロス。 </li><li>フィーダー細胞としてマウス胚性繊維芽細胞（MEF）を準備する。二日胚盤胞の集合前に、MEFのは（2 × 10 6細胞）は、100 mmディッシュに播種されています。翌日は、これらの細胞は37℃で2時間のインキュベーションのためにマイトマイシンC（20 mg / mL）を含む° C、5％CO 2の TSの培地10mlで処理されています。これは、PBSで細胞を2回洗浄することによって続いている。マイトマイシンC処理した細胞を12ウェルプレート（1 × 10 5細胞/ウェル）に播種されています。 </li><li>胚盤胞のコレクション（3.5 DPC、初日と呼ばれる）の日に、MEFの培地は、TS培地に加えて倍速FGF4/Heparin液（0.5ml /ウェル）に置き換えられます。 </li><li>子宮のコレクションのための準備：マウスを安楽死させると子宮（図1A）を探します。 </li><li>子宮頸部（膀胱の後ろにある）で、ピンセットでそれを把握し、子宮を取り出して、子宮と子宮頸部（図1B）の接合間にカット。子宮を引っ張って、膜と脂肪組織を切り落とすと卵管との接合（図1C）下子宮をカット。 60 mmのプレート内のTS培地の少量（0.2 ml）に子宮（図1D）を配置します。 </li><li> 26ゲージの針で1mlのシリンジを使用してTS培地1mlでそれぞれの子宮の角をフラッシュします。子宮の底に針を挿入し、1 mlのTS培地で新しい60 mmのプレートにゆっくりと洗い流してください。子宮が膨張し、フラッシング中に完全に拡張する必要があります。 </li><li>口制御ピペットを使用してTSの培地を含むクリーンな12ウェルプレートに慎重胚盤胞を収集して転送する。 12ウェルプレートでTS媒体を介してシリアル転送で胚盤胞を3回洗浄する。 37マイトマイシンC処理MEFフィーダーや文化を含む° C、5％CO 2を 12ウェルプレートにウェル当たり片足胚盤胞（図2A）。 </li><li>胚盤胞は透明帯から孵化し、24〜36時間でウェルにアタッチされます。小さな突起は容易に3日目に観察される。 500μlの新鮮なTSの培地に加え、1 × FGF4/Heparinと文化を養う。 </li><li> 4または5日目に、胚盤胞の伸長は、そのサイズに応じて分解するための準備ができているはずです。 TSの細胞解離のための理想的なサイズは、図3Bに示されています。 0.5mlのPBSで一回の文化を洗ってください。 37℃で5分間、100ミリリットル0.25％トリプシン/ EDTAとインキュベートする° C、5％CO 2を 。 P100のpipettemanと激しく上下にピペッティングして小さな塊に伸長を破る。井戸に（30％のTS培地、70％MEF - CMプラス1.5 FGF4/Heparin）TS - 70CM - 1.5F4Hを追加することによって、トリプシン処理を停止します。 8時間分解した後、培地を変更し、2日毎に細胞を供給し続けます。 </li><li>日間で6と10（高度に可変）TS細胞のコロニーを観察することができます。彼らは明確なコロニーの境界（図2C）との形態のような平らな、上皮シートを持っている。 2日毎に培養液を供給し続ける</li><li> TS細胞がコンフルエント50％（通常は日15〜20の間）に到達すると、PBSで1回洗浄し、100ml 0.25％トリプシン/ EDTAを加える。近い単一細胞懸濁液を確実にするためにトリプシン処理中に上下にピペッティング。 TS - 70CM - 1.5F4HとマイトマイシンC処理したMEFフィーダー（2.5 × 10 5 cells/6-wellまたは5 × 10 5 cells/60mmプレート）を含む新たな6穴または60ミリメートルプレートへの転送を追加することにより、トリプシン処理を停止します。 </li><li> 8時間経過後に培地を変更し、2日毎に培養液を供給し続けます。 </li><li> MEFフィーダー上に1つまたは2つ以上の通路（通路の間に3〜5日）した後、TSの細胞はそれらなしで培養することができる。 MEFのは、はるかに高速にトリプシン処理後のTS細胞より培養皿に付着するので、接着速度でそのような違いは、MEFフィーダーからTS細胞を分離するために利用することができます。培養細胞を通過した後、° C、5％CO 2で30分間37℃、それらをインキュベートする。ほとんどのMEFはプレートに付着し、TSの人口は、懸濁液中に残ります。新しいプレートに上清を移す。純粋なTSの人口を取得するには、いくつかの文章について、この手順を繰り返します。 </li><li> TS - 70CM - 1.5F4HにTS細胞を維持し、4日ごとに渡す（1:10〜1:20の分割）や、文化が70％コンフルエントに達する。高密度（1:5分割よりも高い）または培養することを過度に合流、その分化を引き起こす可能性のある細胞を渡す。 </li><li> TS細胞の同一性は、細胞マーカー、Cdx2の（図3）の免疫染色によって確認することができます。 </li></ol>凍結TS細胞<ol><li>凍結培地（50％FBS、30％のTS培地および20％DMSO）を2倍用意してください。 </li><li>共同トリプシン処理によってllectのTS細胞は、6分の場合は450gで遠心分離した。 2倍速凍結培地の等量でTS培地に再懸濁します。 </li><li>徐々に-70℃でイソプロピルアルコールチャンバーを用いて細胞を凍結℃、24〜48時間後に液体窒素への転送。 </li><li> 60 mmのプレート（コンフルエント70％）通常2バイアルに保存されています。 </li></ol> TS細胞を融解<ol><li>すぐに37バイアルを解凍° Cは、（450グラム、6分）遠心して10ミリリットルTSのメディアでそれらを収集し、そして30％TSメディア、70CM - 1.5F4Hに再懸濁します。 </li><li>細胞の1バイアルを60 mmのプレートに播種されています。 </li></ol> TGCにTS細胞の分化栄養膜巨細胞（TGCs）にTS細胞の分化は、MEF - CM、FGF4とヘパリンの撤退により誘導され得る。 TGC表現型は（大核）は4日間の誘導後に検出することができる（田中ら、1998とチウら 2008）。 p450sccの免疫染色は、差別化された文化の中でこのTGCマーカー（図4A）の発現を検出する。 PI（ヨウ化プロピジウム）染色された細胞のフローサイトメトリー分析は、さらに高いDNA含量（図4B）を含む分化した細胞の存在を示しています。これらの結果は、TS細胞が倍数体TGCsになるために核内倍加を受けることを示唆している。 代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウスの子宮の解剖。 （A）子宮の位置は矢印で示されます。に示すように（B）子宮および子宮頸部の接合間にカット。 （C）だけで卵巣（OV）の下に卵管（外径）以下の子宮をカット。子宮の（D）イメージ。 <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2代表的な写真は、マウスの胚盤胞、胚盤胞の伸長や栄養膜のコロニーを示しています。 （A）E3.5で収集されたマウスの胚盤胞が表示されます。 ICM、内部細胞塊、MT、壁画の栄養外胚葉、PT、極性の栄養外胚葉。 （B）MEFフィーダー上に栄養膜伸長が表示されます。 TS、栄養膜幹細胞。 （C）栄養膜幹細胞のコロニーは、MEFフィーダー上に明確なエッジを示しています。矢印は、セル境界を示している。 <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3解析を免疫染色によりTS細胞の同定。 TS（AD）とES（制御、EH）の細胞は、マーカーの同定の対象となります。細胞は、Oct4の（A、E）またはCdx2の（B、F）を認識する抗体で免疫染色し、マージされた画像で提示DAPI（C、G）（D、H）によって対比されています。スケールバーは50μm。 <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4 in vitroでのTS細胞の分化。 （A）未分化（Undiff）または差別化（差分）細胞培養においては、TGCのマーカーの発現について調べたところ、p450scc（緑）、DAPI（赤）で対比。 （B）PIで染色された分化した細胞のフローサイトメトリー分析は、DNAの内容を（; M2、以上の4つのコピーM1、2〜4枚）を測定します。 M2の人口は、倍数体栄養膜細胞を表しています。

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このビデオでは、我々は、TS細胞株を確立するために子宮や実験手順からE3.5胚盤胞を収集するプロセスを示しています。我々はまた、TS細胞のstemnessを維持し、分化した細胞への分化を誘導する条件について説明します。純粋なTS細胞株を取得する2つの重要なステップは、伸長の分解のためのタイミング（手順9）と初通過（ステップ11）処理です。それは、大規模な胚盤胞は、手順9または手順11でTSのコロニー（&gt; 50％コンフルエント）（Kunathら、2005）の繁茂に脱却した後、原始内胚葉由来の細胞が培養で生じることが報告されている。原始内胚葉由来の細胞は丸みを帯びた細胞の形状やTS細胞と比較して減少した細胞間接触を持つ彼らの独特の形態によって識別することができますが、彼らはTSの培地でよく育つとしないので、それは文化からそれらを除去することは困難です。 MEFフィーダーまたはFGF4を必要とするように思われる。 差別TGCsもMEF - CMとFGF4の存在下でTSの文化の中で絶えず発生する可能性があります。純粋なTSの人口を希望する場合は、これらの分化細胞は、差動付着率に基づい...

試薬 TS媒体： RPMI - 1640、20％FBS、1mMピルビン酸ナトリウム、100mMのβ-メルカプトエタノール、100 mg / mlのペニシリン - ストレプトマイシン。 マイトマイシンC： 2ミリリットルのPBSで2 mgをマイトマイシンC（シグマM - 0503）を溶解し、200ミリリットルのTS培地（10 ng / ml）の中にこの2mlの混合物を追加。使用するまで-20℃で20分注し（10ml）とストアを行います。 100 mmのプレートごとに一定量を追加。 マウス胚性線維芽細胞条件培地（MEF - CM）： 100 mmのプレート（1 × 10 6 /プレート）にプレートのMEF。翌日、皿当たり10mlのTS培地を追加し、48時間培養を続ける。それらをフィルタリング（0.45 mm）とを35mlのアリコートで-20℃で保存し、培養液を集める。 4℃で保存することができます必要に応じて各アリコート℃を解凍MEFのは、彼らがコンフルエントになる前に、CMの2つのバッチを準備するために使用することができます。 PBS / BSA： 0.45ミリメートルシリンジフィルターを通してフィルターPBS（10ml）に、のBSA、フラクションV（シグマA3311、0.1％（w / v）の）溶解し、1.5 mlチューブに1 mlのアリコートを行います。 -70℃で保存し、FGF4を準備するために必要な雪解けつのチューブを。 FGF4（1000X）： PBS / BSA溶液1 mlで再懸濁し凍結乾燥FGF4（シグマF8424、25mg）を。 -70℃でよく混ぜ合わせ、1.5 mlチューブ用と店舗に10アリコート（100ml）を加える℃に必要に応じて各チューブを融解し、4で、残りを保存° Cは、再凍結しないでください。 1X FGF4（25 ng / ml）を取得するためにTS培地で1000倍に希釈する。 ヘパリン（1000倍）。 1 mg / mLの（1000倍）の最終濃度にPBSで再懸濁し、ヘパリン（シグマH3149、1万台）。 -70℃で1.5 mlチューブや店舗に100 mlのアリコートを作る℃に雪解けのアリコートに必要と4で、残りを保存° Cは、再凍結しないでください。 1Xヘパリン（は1 ng / ml）を得るために、TS培地中に1000時間を希釈する。

胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

栄養外胚葉の仕様は、哺乳類の発生の最も初期の分化のイベントの一つです。栄養外胚葉を仲介移植から派生し、絨毛の系統は、胎盤の胎児の一部を生成します。その結果、この系統の開発は、胚の生存に必須です。マウスの胚盤胞から栄養膜幹細胞（TS細胞）の導出は、最初に田中によって記述されていた<em&gt;ら。</em&gt; 1998。適切な刺激の後のステージと細胞タイプ特異的マーカーのトロホブラスト特定のプロパティとそれらの発現を維持するためにTS細胞の能力は、初期の胎盤形成のイベントをrecapitulatingにより栄養膜の系統の開発を調査する貴重なモデルシステムを提供します。さらに、栄養膜細胞は、天然のゲノム増幅を受けているいくつかの体細胞のタイプのいずれかです。栄養膜polyploidizationの根底にある分子経路が解明し始めているものの、栄養膜のゲノム増幅の生理的役割と利点は、主にとらえどころのないままです。文化における倍数体栄養膜細胞への二倍体性幹細胞の開発は、このしています<em&gt;生体外で</em&gt;システムの健康と疾患におけるゲノム複製と不安定性の調節機構を解明するための優れたツール。ここでは、チウに発表された変更と、以前の報告に基づいてプロトコルを記述する<em&gt;ら。</em&gt; 2008。

このビデオでは、我々はマウス胚盤胞と胚盤胞から栄養膜幹細胞の派生の分離を示しています。我々はまた、幹細胞のプロパティのメンテナンスだけでなく、文化の分化誘導のための条件について説明します。

栄養外胚葉（trophectoderm）の特定は、哺乳類の発生における最初期の分化イベントの一つである。～に由来する栄養膜細胞（trophoblast）系譜は……

この手順の全体的な目的は、マウスの胚盤胞からTS細胞を誘導することです。まず、妊娠マウスから子宮角を単離し、胚盤胞を回収します。次に、MEFフィーダー上のTS細胞の増殖に適した条件下で、胚盤胞を培養します。本手順の第3段階は、TSコロニーを拡大し、最終的にメチル化基質（meth feeders）を除いた状態でTS細胞を培養することです。最終段階では、幹細胞特性を維持したままTS細胞を培養し、凍結保存を行い、または栄養膜細胞への分化を誘導します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、未分化TS細胞における栄養膜幹細胞マーカーCDX2の発現、あるいは栄養膜巨細胞へ成熟した後の分化マーカーKRT8/18（p450 SCC）の発現を示す結果を得ることができます。こんにちは。ロチェスター大学医療センター生物医学遺伝学部研究室のShani Chuです。本日は、栄養膜幹細胞の培養手順についてご紹介します。私たちはこの手法を用いて、栄養膜の増殖と分化、および健康な胎盤を形成する上での胚外組織における役割を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始するために、目的のマウス間で交配を行います。次に、フィーダー細胞としてマウス胚性線維芽細胞（MEF）を準備します。 blast assist plate の回収の2日前、100 mmディッシュでmesを培養します。翌日、これらのmeth細胞を、20 µg/mLのmitomycin Cを含む10 mLのTS培地で、37 °C、5% CO₂条件下で2時間処理します。2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、mitomycin C処理したmeth細胞を10 mLのTS培地で再懸濁し、12ウェルプレートに播種します。blast assist回収当日に、meth培養液をTS培地および1X FGF4 heparinに置換します。それでは、マウスの子宮から胚盤胞を回収します。まず、安楽死させた動物を仰向けに寝かせ、皮膚と被毛を70%ethanolで清拭します。次に、側面に小さな切開を加え、皮膚を頭側に引いて腹部を露出させ、腹膜を側方に向かって切開します。腹腔を露出させ、子宮を確認します。膀胱の後方にある子宮頸部を鉗子で把持し、子宮と子宮頸部の接合部を切断して子宮を取り除きます。子宮を牽引し、膜組織や脂肪組織を切り除きます。次に、卵管との接合部より下で子宮を切断します。子宮を60 mmプレート内の0.2 millilitersのTS培地に置きます。ここで、1 milliliterシリンジに1 milliliterのTS培地を満たします。26ゲージの針を取り付け、片方の子宮の基部に針を挿入します。新しい60mmプレートにゆっくりとフラッシュします。フラッシング中、子宮は膨らみ、完全に伸展している必要があります。同様に、マウス制御ピペットを用いてもう一方の子宮角を洗浄します。胚盤胞を回収し、TS mediumを含む清潔な12ウェルプレートに慎重に移します。12ウェルプレート内のTS mediumを用いて、連続的な移送により胚盤胞を3回洗浄します。各ウェルにブラストアシストを1つずつ配置します。37 °C、5% CO₂条件下で、マイトマイシンC処理済みのMEFフィーダー細胞を培養した12ウェルプレートを使用してください。ブラストアシストは24～36時間以内に透明帯から脱出（ハッチング）し、ウェルに接着します。3日目に小さな外胚葉様組織の突出（outgrowth）が容易に観察されます。4日目または5日目に、500 µLの新鮮なTS培地と1X FGF4-heparinを加えて培養液を補充してください。blast assist outgrowthは、その大きさに応じて解離可能な状態になります。TSL分散に最適なサイズをここに示します。培養物を0.5 millilitersのPBSで1回洗浄します。次に、0.25%trips in EDTAを100 microliters加え、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideで5分間インキュベートします。これで、本手順においておそらく最も重要な工程である、細胞塊（ブラスト）の解離準備が整いました。次に、P100ピペットを用いて激しくピペッティングし、ブラストアシスト outgrowthを小さな凝集塊に分断します。ウェルに0.5 mLの70 cm 1.5 F four H mediumを添加してトリプシン処理を停止させ、直ちに細胞をインキュベーターに戻します。解離から8時間後に培地を交換してください。6日目から10日目の間、2日ごとに細胞に培地を添加し続けます。この期間は個体差が非常に大きくなります。TSLコロニーが観察されます。これらの細胞は、明確なコロニー境界を持つ扁平な上皮シート状の形態を示します。通常15日から20日の間で、TS細胞が50%コンフルエンスに達するまで、2日ごとに培養液の交換を継続します。PBSで1回洗浄し、0.25%トリプシンEDTAを100 µL添加します。トリプシン処理中にピペッティングを行い、ほぼ単一細胞懸濁液になるようにします。5分後、7 mLのDCM 1.5 F四H培地を加えてトリプシンを停止させます。次に、細胞をあらかじめ調製したマイトマイシンC処理済みのmethフィーダーを含む新しい6ウェルプレートに移し、37°C、5% Carbon dioxideでインキュベートします。継代の8時間後に培地を交換し、その後は2日ごとに培養液を補充し続けます。methフィーダー上でさらに1〜2回継代した後、TSLをmethフィーダーから分離させるために、フィーダーなしでTSLを培養することができます。培養細胞を継代した後、37°C、5% 二酸化炭素条件下で30分間インキュベートします。トリプシン処理後、mesはTS細胞よりもはるかに速く培養プレートに接着するため、ほとんどのmesがプレートに接着し、TS細胞の集団は懸濁状態のままとなります。上清を新しいプレートに移します。純粋なTS細胞集団を得るために、methフィーダーからTS細胞を分離するこの工程を数代の継代にわたって繰り返します。TS cellは70 cmのフラスコ内で1.5 F four H培地を用いて維持し、4日ごと、またはコンフルエンシーが70%に達した時に継代します。最終的に、細胞マーカーの免疫染色によりTS細胞の同一性を確認できます。CDX 2を用いてTS細胞を凍結させ、イオン化により回収し、続いて450 Gで6分間遠心分離します。細胞をTS培地と等量の2倍凍結保存液の混合液で再懸濁し、クライオバイアルに移します。通常、70%コンフルエントの60 mmプレート分を2本のバイアルに保存します。細胞を-70°Cのイソプロピルアルコールチャンバーを用いて緩慢凍結させます。24〜48時間後に液体窒素へ移送します。TSLの融解は、バイアルを37°Cで急速に融解させることで行います。haw細胞を10 mLのTS培地を含む15 mLチューブに移し、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を70 cm、1.5 F four H培地で再懸濁し、各細胞バイアルを60 mmプレートに播種します。TS細胞から栄養膜外巨細胞（tgc）への分化は、MEC fourとヘパリンを除去することで誘導できます。T GCsは、核と細胞体が肥大しているため、培養中で容易に識別可能です。TGC表現型は、ここで観察されるように、緑色で示されるTGCマーカーP four 50 SCCの免疫染色と、赤色で示されるDAPIの対比染色によっても検出可能です。分化した細胞はP four 50 SCCを発現しますが、未分化の細胞は発現しません。プロピジウムヨードで染色した分化細胞のフローサイトメトリー解析では、さらに高いDNA含量が示されており、M1は2〜4コピー、M2は4コピー以上のDNAを表しています。これらの結果は、TSLが内倍数化（endo reduplicating）を起こし、M2集団で代表される多倍体TCSになることを示唆しています。ここでは、ブラストシスからブラストシスを回収し、そこからマウスTS細胞を誘導する方法について説明しました。TSLラインを確立する際は、アウトグロースを注意深く観察し、培養条件下で多能性が維持されていることを確認することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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生物学

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