Name: マウスにおける膵β細胞の質量のその場定量に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶマウス膵臓全体のGFP標識β細胞の仮想スライスイメージングと定量化手法。パラホルムアルデヒド、Triton X、スクロース、グリセロール処理による組織透明化と蛍光顕微鏡観察により、膵島の数・サイズ・分布を解析し、糖尿病研究におけるβ細胞動態の理解を深めます。

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研究は、シカゴの糖尿病研究研修センター（動物モデルコア）、およびKovlerファミリー財団からの贈り物の大学に米国公衆衛生サービスグラントDK - 081527、DK - 072473とDK - 20595によってサポートされています。

第1部：試験片の調製<ol><li>解剖顕微鏡下でマウスを置く、まだ接続されている十二指腸と脾臓と一緒に全体の膵臓を削除して、事前に計量したガラススライド上に臓器を置きます。それは膵臓にバインドされている側に沿って結合組織を切断して十二指腸を削除します。膵臓が完全にスライドで隔離されるまで、膵臓で脾臓や余分な脂肪をカットして取り外します。 （膵組織の少し暗いとタナー色から分化したと膵脂肪は、その白い色で区別できる。） </li><li>それが完全に覆われるように膵臓上、カバースリップを（標準のカバーガラス25x75mm 50x75mm大型カバーガラス）に置きます。スライドとカバーの間に膵臓を平坦にする（重い本など）の重量を使用してください。重量に応じて、膵臓を平坦化すること約5分かかります。 </li><li>重量をはずしなさい。膵臓は、スライドに対しても平坦化の場合は、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）に置きます。午前中は、カバーガラスを取り除き、よく日中のPFAに膵臓全体を（6-8時間）に公開。膵臓が十分に固定されていない場合、それは、長いPFAでおそらく一晩おくことができます。一晩（PBS）リン酸緩衝生理食塩水にトリトンX - 100 1％でコンテナにスライドを移し。翌日、1〜2日のために飽和ショ糖の容器にスライドを転送する。その後、蛍光シグナルの最適な解像度を可能にする組織がクリアされるまで100％のグリセロールの容器、にスライドを移転すること、組織の清算は、約1-3日かかります。 （蛍光シグナルは、数週間、および月間持続することがありますが、組織が最適な解決のためにクリアされた後の画像をすぐに実行する必要があります。） </li><li>オルガンとその蛍光シグナルを維持するために暗く、涼しい場所で膵臓を保管してください。 </li></ol>第2部：画像及び無傷の膵臓のβ細胞の面積を定量化<ol><li>ピンセットや手袋をはめた手を使って、100％のグリセロールとコンテナのスライドを取り出します。過剰なグリセロールを拭き取り、排他的にエタノールでカバーガラスの背面をクリーニングによりイメージングのためのスライドを準備します。 </li><li> StereoInvestigatorソフトウェア（MicroBrightField、ウィリストン、バーモント州）を開き、3つの大きなガラスのスライド上で数週間、または2つの25ミリメートルカバーガラスの間に押された3週間より膵臓若いイメージングマウスの10倍の対物レンズより膵臓古いイメージングマウスの2倍の対物レンズを選択します。画像（イメージ→ライブイメージを）生きるためにそれを設定して、イメージを視覚化する。明らかにGFP -タグ付きβ-細胞を示して露光時間を選択してください。 （画像をover​​exposingには、追加の偽信号を作成しながら画像をUnderexposingと、小さな島とβ-細胞を除きます。） </li><li>基準点を確立するために画面上の任意の場所をクリックし、全体の膵臓の周りに輪郭を描画するために進んでください。仮想スライスのプロセス（画像→仮想スライスを取得）を開始します。最高の焦点面、すなわち、フォーカスノブをスクロールしてZ軸上で可視的を絞った島とβ-細胞の数が最も多い平面を決定し、選択します。選択後は、StereoInvestigatorは自動的に画面に表示された画像をキャプチャします。電動ステージで、仮想スライス機能は、連続して描かれた輪郭（図1A）内に個別のイメージとしてそれぞれの光学パネルをキャプチャして、1つのマージされた画像（図1B）として、それらのすべてを兼ね備えています。仮想スライスイメージングは​​、落射蛍光コンフィギュレーションを使用して、最終的なバーチャルスライスが最大ではない統合された二次元画像になるようにカメラがない完璧にピントのものも含めて一定の深さに存在するすべての信号を、キャプチャすることができますすなわち、広視野フィルタ膵臓全体の三次元再構成からの投影。平均的な仮想スライスのスキャン時間は、サンプルあたり30分ですが、大規模な膵臓のために時間かかることがあります。 </li><li>画像を保存した後、ImageJを使用してイメージを開放することで、その分析を開始。画像のロードが完了し、画面に表示されたら、仮想スライス分析マクロを（開いて実行<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material%201.pdf">補足資料1</a> ）。 </li><li>マクロで提供されるステップバイステップの指示に従ってください。 "魔法の杖"と"範囲選択"ツールを使用して光散乱によって作成された不要なアーチファクトを除去する。画像から不要な背景を確認し、引く。その後のローリングボールの機能が効果的に自家蛍光や散乱光を除去できるように、"ライン"ツールとの最大の膵島の半径を決定する。 β-細胞の小さな島とクラスターの蛍光シグナルを捕捉するために最も適切な"低しきい値"をテストし、選択（&lt;3 × 10 4μmの2）。膵島の蛍光シグナルを捕捉するために最も適切な"最大しきい値"をテストし、選択してください。測定される仮想スライス、の定量化を実行します。と膵島面積、周囲、真円度、およびフェレーの直径のリストを生成します。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="図1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1a"> そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1A仮想スライスの画像解析 10週の雄マウスの膵臓の個々の光学パネルの画像は、2倍の目標の下で撮影。イメージがさらに膵島、β細胞の小さなクラスター（&lt;10細胞）のディストリビューション全体が含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="図1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1b"> そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1B仮想スライスの画像解析 右側の背側膵と左の腹側膵と統合された仮想スライス。スケールバーは5 mmである。 代表的な結果バーチャルスライスイメージングのための膵臓の熟練準備ははっきりと異なる島で仮想スライス画像全体膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞の効果的な定量化が可能になります。 その場で膵臓全体の成功バーチャルスライス画像も同様にβ-細胞のみならず、個々と全体の膵島面積だけでなく、膵島のサイズ分布、地域分析、および成長パターンを調べ、定量化する手段を提供します。 ImageJは仮想スライス画像の分析で同時にすべてのβ-細胞を検出する能力を維持しながら、それはまた、特定の膵島のサイズ（面積または直径によって）に分析を制限することによって、または場所によって定量化するためのβ-細胞を制御することができます。標準分析では、アーティファクトの例、単一のβ-細胞（&lt;170μmの2）と、レコード領域、周囲（地域を取り巻く距離）、循環（1.0は完全な円を表す真円度、）よりも小さい破片を、除外と各島のためのフェレーの直径（エリア内の最も長い距離）が検出されました。仮想スライス分析は、その形状に応じて個々の小島に重なって島を区別し、分離流域セグメンテーションを採用することで、仮想スライス画像を向上させることが可能です。分析は、さらに詳細な一連のイメージを生成しますが、これはそれぞれ個別の番号と対応する情報（図中の表に記載されている低域と高強度（図1C）の両方の下の画像のマスク、すべての推定膵島の輪郭を、含まれています。1D）、そしてオリジナルの仮想スライス画像（図1B）。しきい値を選択する潜在的な技術的なバイアスが大規模な構造を囲む余計な光を含むことにより、または特に小島、小さな粒子からの微弱な信号の総数を減らすことによって、島のスキュー定量化できることに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="図1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1c"> そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1C仮想スライスの画像解析 仮想スライスの蛍光粒子のマスク。カラーコード：[1]青：低強度の蛍光、[2]緑：中間強度の蛍光、及び[3]赤：高輝度の蛍光。 <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="図1d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1d"> そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の1次元仮想スライスの画像解析を図 個々の島/β-細胞のクラスターの定量化。各島が（β-細胞の小さなクラスターを含む）対応するグラフで説明するその情報を、番号付けされていることに注意してください。 （3）真円度、（2）境界、（1）面積：：4つのパラメータは、それぞれの構造のために採取した数1.0は完全な円を表す丸みの程度、（4）フェレーの直径：エリア内で最長の距離。 ＃706はわずか数β-細胞の面積と分析結果の解像度を表示することに注意してください。流域セグメンテーションなど示されているものとして、隣接する島のグループを検出し、適切に明確な小島（小島1554、1555、および1556）として、それらを区別します。 <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="図1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1e"> そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1E仮想スライスの画像解析 面積、境界、およびフェレーの直径の軸を持つ仮想スライスの解析の3次元プロット、。各ドットは、膵島を表します。

<ol><li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

無傷の膵臓のランゲルハンス島とβ細胞のクラスターの仮想スライス画像の解析は、島の全体の分布の大規模なビューを提供します。発展と時間をかけて合計膵島の分布の変化は、このように研究し、比較することができます。そのような例は、膵島の形成の分析（1）で示されています。様々な時点（P1 - P21）での新生児マウスの膵臓の包括的な分析は、島が分裂によって形成されることが実証されています。 β-細胞の増殖は、P12以降P1 - P10、膵島の分布から、マウスで対数正規確率密度関数でフィットしながら核分裂の過程を示唆し、対数正規分布のパターンから離れて左方向にずれる。同様の分析は、進行性のピーク位置とx軸のスケールのパラメータを持つ対数正規関数を装着したマウスのインスリノーマの開発、およびべき乗分布（2）上で行った。 <img src="/files/ftp_upload/1970/1970fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> P（x）は=斧yを 。データを効果的に面積、周囲とフェレーの直径（図1E）...

<table><tbody><tr><td>ピンセット</td><td>Miltex Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>F.S.T.</td><td>14001-13</td><td>01n2</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>F.S.T.</td><td>14072-10</td><td>02s5</td></tr><tr><td>大型ガラススライド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71862-01</td><td>75x51x1.2mm</td></tr><tr><td>大型カバーガラス</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260462</td><td>50x75mm</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25x75x1.0mm</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-458-5M</td><td>75x25mm</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Erie Scientific</td><td></td><td>25mm 円形</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-GFP マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける膵β細胞の質量のその場定量に

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

健康と病気の特定の細胞集団の変化をトレースすると生物医学研究の重要な目標です。モニタリングの膵臓β細胞の増殖および膵島の成長のプロセスは特に困難である。我々はImageJ（rsb.info.nih.gov / IJ /）用に書かれたマクロを使用して蛍光タグ付きのβ-細胞とトランスジェニックマウスの無傷の膵臓のβ細胞の分布をキャプチャする方法を開発した。膵臓の解剖と組織の清算に続いて、全体の膵臓は、その後GFP -タグ付きβ-細胞が検討されている、仮想スライスとしてキャプチャされます。分析は、各島のためとβ-細胞の小さなクラスターのための特定のパラメータとの位置への参照を使用して、全β-細胞の面積、膵島の数とサイズ分布の定量化が含まれています。島の全体的な分布は、3次元にプロットし、各島のサイズと形状分布からの情報が一目で全体的なβ細胞面積の変化の定量的および定性的な比較を可能にすることができます。

以下のプロトコールは、膵臓の仮想スライスイメージングのための解剖、および全体の膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞のその後の定量化のプロセスを概説します。

健康および疾患状態における特定の細胞集団の変化を追跡することは、生物医学研究における重要な目標です。膵臓のモニタリングプロセスにおいて...

膵β細胞の増殖とアイレットの成長を理解することは、糖尿病研究における重要な側面です。このビデオ論文では、GFPを発現するβ細胞を持つマウスを用い、マウス膵臓全体のイメージングと解析について実演します。安楽死させたマウスから膵臓を摘出し、ガラススライド上で平坦化させます。その後、パラホルムアルデヒド、Triton X、スクロース、およびグリセロールによる連続的な処理によって膵組織を透明化し、蛍光顕微鏡で観察します。膵臓の画像または仮想スライスを取得します。その後、画像を解析して、膵臓内における膵島の数、サイズ、および分布を決定します。こんにちは、シカゴ大学医学部のDr.RAの研究室のGerman Kilimnikです。HAR LabのAbraham Kimです。本日は、マウス膵臓内のすべてのベータ細胞をイメージングし、定量化するための手法をご紹介します。当研究室では、マウスのアイレット構造、発生、および形成を研究するためにこの手法を用いています。それでは開始します。まず、被毛による汚染を防ぐため、マウスの皮膚に95% ethanolを塗布します。次に、マウスの腹側の皮膚を持ち上げ、下腹部付近を切開します。体の両側をU字型に切開します。臓器を露出させるため、GFPでラベル化されたβ細胞を持つ安楽死させたマウスを解剖顕微鏡下に置きます。ピンセットを使用して、脾臓が付着したままの十二指腸とともに膵臓全体を取り出し、スライドガラス上に置きます。次に、膵臓に付着している側から結合組織を切断し、十二指腸を取り除きます。脾臓および膵臓に付着している白色の余分な脂肪を切除して取り除きます。膵臓がスライド上で完全に単離されるまでこの操作を続けてください。その後、スライド上で膵臓の重量を測定します。次に、膵臓全体が覆われるようにカバーガラスを被せます。重りを使用して、スライドガラスとカバーガラスの間で膵臓を平らに押し潰します。膵臓が平らになるまで、約 10 分間放置してください。10分経過後、重りを取り除き、スライドを4%パラホルムアルデヒドまたはPFAに浸します。次に、スライドを4°Cで一晩保存します。翌朝、カバーガラスを取り除き、膵臓全体を4°CのPFAにさらします。8時間後、膵臓を観察します。十分に固定されておらず、生の状態に見える場合は、再びPFAに戻し、固定を継続して一晩固定します。スライドをPBS溶液中の1% Triton X 100が入った容器に移し、4°Cで一晩保存します。翌日、スライドを飽和ショ糖溶液の容器に移します。4 °Cで1〜2日間インキュベートしてください。その後、最適なイメージング解像度を得るために、スライドを100%グリセロールの容器に移します。組織が透明になり、透き通って見えるまで、スライドを1～3日間グリセロールに浸漬させておきます。右側に示され

in-situ-quantification-of-pancreatic-beta-cell-mass-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

免疫組織化学染色した膵臓標本の大規模な調達と分析の新たなコンピュータ支援の方法が説明されています：セクション全体の（1）仮想スライスのキャプチャを、大規模データの（2）質量分析、2D仮想スライスの（3）復興（4）3Dの膵島のマッピング、および（5）数理解析。...

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

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ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

このプロトコルの目標は、マウスの同所性膵臓腫瘍異種移植片に対して動的コントラスト増強磁気共鳴画像法(DCE-MRI)を適用することです。DCE-MRIは、標的組織の微小血管系を非侵襲的に解析する方法であり、新規治療後の腫瘍の血管反応を評価するのに役立ちます。...

同所膵臓癌マウスモデルのダイナミックコントラスト強化磁気共鳴画像

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

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このプロトコルは膵臓のβ細胞のmitophagyの量的な分析のための2つの方法を輪郭を描く:...

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マウス膵臓内皮細胞の単離

この研究では、細胞死とアポトーシスのマルチ染色蛍光ベースのマーカーを共焦点顕微鏡と組み合わせて使用し、膵島におけるサイトカイン誘発性アポトーシスとβ細胞特異的死を評価します。細胞外刺激に応答した細胞死とアポトーシスの空間的および時間的変化を明らかにします。...

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本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

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マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

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