Name: エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ定量的リアルタイムPCRを用いたエメラルドアッシュボーラーの組織別・発育段階別遺伝子発現解析法。幼虫組織の解剖とRNA抽出からcDNA合成、遺伝子発現の定量分析までを網羅的に解説します。

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我々は、実験のセットアップでルルドデルタArruetaアンテケラ（昆虫学科、オハイオ州立大学/ OARDC、ウースター、オハイオ州）が提供するヘルプを認めます。我々は、EAB幼虫のサンプルを送るための博士テレーズポーランドを（USDA、森林サービス、NRS）感謝。顕微鏡のセットアップが認識されているとDr。ルイスカナスとNuris Mアコスタが提供するのに役立ちます。このプロジェクトの資金は、オハイオ農業研究開発センター、オハイオ州立大学に充当州と連邦資金によって提供されていました。

別のステップで完全なプロトコルは、図1のフローチャートに示されている。解剖を構成する個々のステップは、RNA抽出、ファーストストランドcDNA合成や定量RT - PCRは以下に詳述する。 I.幼虫の解剖<ol><li>この手順の開始時、代わりにエメラルド灰ボーラー、またはEAB、湿ったティッシュペーパーで幼虫の前に解剖が行われるまで。新しく調製した1Xリン酸塩は解剖を通してバッファの寒さを保つために氷の上で、またはPBS、生理食塩水バッファリングしてください。 </li><li>開始するには、微細な解剖ピンと解剖板にEAB幼虫を修正。その後、解剖の板に冷1X PBSを加える。 </li><li>最初に、解剖鋏の罰金ペアで幼虫を斬る。その後、幼虫の最後の腹部のセグメントを削除します。 </li><li>鉗子の時計職人のペアを使用して、幼虫の死骸からキューティクルを持ち上げます。その後、はさみを使用して、枝肉の長さに沿って切開を行います。切開がなされると同時に破裂腸をしないように注意してください。 </li><li>慎重にそのような脂肪体や結合組織などの他の組織から中腸組織を分離する。その後、fatbodyのコンタミネーションがないことを保証するために新鮮な1 × PBS緩衝液中の組織をすすいでください。 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにあらかじめ冷却Trizol試薬を500μLに分離された腸を転送します。 </li><li>次に、鉗子を用いて脂肪体の組織を分離し、チルドTrizol試薬500μLを含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li>最後に、組織の整合性を傷つけないように注意しながら、任意の付着組織をオフ解体によって幼虫の死骸から表皮組織を分離する。新鮮なPBSバッファーで分離された表皮の組織をリンスし、チルドTrizol試薬500μLを1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li>孤立した脂肪体、表皮と中腸組織を-80℃で保存できますRNA抽出までのC。 </li><li> RNA抽出のための準備として、発達段階に応じて様々なEABのサンプルを並べ替える。これらの段階は、1次、2次、第3、および4次齢期、prepupaeと大人が含まれています。 </li></ol> II。 RNA抽出（TRIzol試薬を用いての一人当たりの製造業者のプロトコルとして） 均質化<ol><li> RNAの抽出を開始するには、まずトリゾール含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに組織を均質化するプラスチック製乳棒を使用してください。均質化した後、Trizol試薬でそれぞれサンプルTO1 mLの合計量をもたらす。 </li><li>発達段階の場合は、乳鉢と乳棒で液体窒素で全体の動物をホモジナイズする。その後トリゾールの1mLにホモジネートのアリコート（50μg）を追加。 </li></ol>相分離： <ol start="3"><li>室温で15分間1 mLのトリゾールでサンプルチューブをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、各チューブにクロロホルムの200μLを加える。すぐにクロロホルムを加えた後、約15秒間激しく振らない。その後、さらに2〜3分間室温でチューブをインキュベートする。 </li><li>次に、2℃で15分間12,000 xgでサンプルを遠心遠心分離後、RNAは水相になります。水相の体積は600μlの、または、総トリゾール容積の60％にする必要があります。 </li></ol> RNA沈殿<ol start="6"><li>慎重にのみ水相を除去。水相以下の物質の存在は、抽出されたRNAのコンタミネーションの原因となります。その後、適切に標識された1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに水相を移す。 </li><li>水相からRNAを沈殿させ、各チューブにイソプロピルアルコール0.5 mLを混合する。室温で10分間サンプルをインキュベートする。インキュベーション後、2℃で10分間、12,000 xgでチューブを遠心</li></ol> RNAウォッシュ<ol start="8"><li>遠心分離に続いて、チューブから上清を捨てる。 RNAは、チューブの底に形成されたゲル状のペレットに存在しています。トリゾールの1mLあたり75％エタノールの少なくとも1 mLを加え、75％エタノールでペレットを洗浄します。ボルテックスにより混和する。その後、2℃で5分間7500Xgでチューブを遠心</li></ol> RNA溶出<ol start="9"><li>チューブから上清を捨てる。 1分間の小さなテーブルの遠心機で再びチューブを遠心してください。慎重にピペットでチューブから余分な上清を取り除きます。管が開いたままにしておくと5〜10分間ペレットの空気は乾燥させて。これは大幅にその溶解度が低下すると上のペレットを乾燥しないように注意してください。 </li><li>空気乾燥した後、でペレット懸濁します<a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">ジエチル</a> 、またはDEPC処理水を。ペレットを再懸濁するために使用される水の量は、ペレットの大きさに依存します。 SMのためのDEPC処理水50μLを使用大きなペレットのすべてのペレットまたは100μL。ペレットが完全に上下に数回ピペットの先端を移動することによって、DEPC処理水に溶けてみましょう。 </li><li>ペレットが溶解した後、10分間55℃でサンプルを置きます。 </li><li>その後、光度計分光光度計（RNAサンプルを2μL）を使用して、各RNAサンプルの濃度を測定する。 </li><li> -80 RNAサンプルを格納℃でさらに使用するまで。 </li></ol> III。ファーストストランドcDNA合成（Invitrogen社のSuperScriptファーストストランド合成キットを使用してあたりの製造業者のプロトコルとして。） <ol><li>各RNAサンプルについてPCRチューブに以下を追加します。 <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> Xμlを</td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックスM </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td>オリゴ（dT）（0.5μg/μLの） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPCは水を扱わ</td><td> （8 - x）を添加</td></tr><tr><td> 総量： </td><td> 10μlの </td></tr><tr><td colspan="2">注：xはcDNA合成に使用するRNAの量です。 RNAの濃度に応じて、RNAの2-3μgの各反応に使用され、各反応の合計量は10μlにする必要があります。 </td></tr></tbody></table></li><li> 4分間で65サーマルサイクラーで上記の反応ミックス° Cを置きます。 </li><li> theromocylerからチューブを外して、少なくとも2分間、すぐに氷上に置きます。 </li><li>以下を追加することによって、最初の鎖のマスターミックスを調製する： <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 25mMのMgCl 2の </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNaseの出</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table></li><li> 、RNAサンプルを含む各チューブにマスターミックスの9μlを加えペッティングにより混合し、混合物を手短に遠心します。 </li><li>クラーに戻ってチューブをセットし、42℃で2分間インキュベート</li><li>一時停止クラーと各チューブにSuperscript II逆転写酵素酵素（Invitrogen社）を1μl加える。この手順は素早く行う必要があります。 </li><li> 1.5時間42℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 70反応℃で15分間を終了します。 </li><li>クラーからチューブを取り出して、氷の上に置きます。 </li><li>各チューブにRNase H 1μlを加え、37℃でサーマルサイクラーに戻して置きます℃で20分間。 </li><li>クラーからサンプルを取った後、各チューブにヌクレアーゼフリー水20μlを加える。各サンプルの体積は、この段階で倍になります。 </li><li>サンプル2μlを用いて各サンプルの濃度を確認してください。定量RT - PCRで使用するために20ng/μlの濃度を作るために、各試料のアリコートを取る。 20ng/μlの濃度にサンプルを補うために水の量は、合成されたcDNAの初期濃度に依存します。 </li></ol> IV。定量RT - PCR： リファレンス遺伝子のプライマーの設計と測定<ol><li> 60 ° Cと〜100ベーシスポイントの製品サイズの融解温度（Tm）と設計プライマー。 </li><li> AP - PERI1は、この実験の目的の遺伝子として使用されます。リファレンス遺伝子や内部統制は、データの後の分析と正規化のために必要とされる。リボソームタンパク質（AP - RP1）がこの実験のためのリファレンス遺伝子として使用されます。 </li><li>ご参照の遺伝子を含む使用されるプライマーの5uMワーキングストックを準備する。 </li></ol>標準の調製<ol start="4"><li>標準がなされるべき使用されているプラ​​イマーの効率を計算するために。 </li><li>テストされるさまざまなサンプルからのcDNAのミックスをしてください。 </li><li>グラフ内の各目的のポイントの5倍希釈系列を作る。四希釈は十分なはずですが、5を強くお勧めします。 </li><li>ボリュームが使用されているポイント数とどのように多くの技術的複製によって異なります。十分なリファレンス遺伝子を含むテストされる各遺伝子のための標準を作るためにあるはずです。 </li></ol>プレートテンプレート<ol start="8"><li>定量RT - PCRプレートの各ウェルのサンプル名を示すテンプレートを設計します。各遺伝子の基準と少なくとも二つの技術は、サンプルあたりの複製を含めることを忘れないでください。 </li></ol>サイクリングのパラメータを設定する<ol start="9"><li>に定量RT - PCRマシンの電源を入れ、サイクリングパラメータを入力します。次のようにこの実験のためのサイクリングパラメータは、次のとおりです。 ステップ1： <ul><li> 1サイクル：95℃で3分間</li></ul> ステップ2： <ul><li> 40サイクル：95℃15秒、60℃で30秒続く （オプション：融解曲線を決定するためには、次の手順を含む） </li></ul>ステップ3： <ul><li> 1サイクル：95℃1分</li></ul> ステップ4： <ul><li> 1サイクル：55℃1分</li></ul> ステップ5： <ul><li> 81サイクル：55℃30秒</li></ul></li></ol> CFX96（BioRad社）マシン用に設定されたプレート<ol start="11"><li>別のチューブ内の各遺伝子（リファレンス遺伝子を含む）のためのマスターミックスを調製する。各ウェルについて、マスターミックスは、構成されています<table border="0"><tbody><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 2.5 X SYBRグリーン</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>プライマーリバース</td><td> 1μL </td></tr><tr><td> 合計ボリューム </td><td> μlの8 </td></tr></tbody></table></li><li>準備中にマスターミックスは、ピペッティングエラーのアカウント1-2余分な反応が含まれています。 </li><li>以前に設計されたテンプレートに従って、各ウェルにcDNAを2μL（20 ng /μLの）追加。その後、反応あたり10μLの合計量で、その結果、各ウェルにマスターミックスの8μLを加える。 </li><li>サンプルがよく混合されていることを確認するまでピペットとダウン（2 - 3X）。液体が先端にとどまるいないことを確認してください。クロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルのための新しいヒントを使用してください。 </li><li>プレート全体をセットアップしたら、光学テープでプレートをカバーしています。グリースの存在は読書に影響を与えることができるようにテープに触れないようにしてください。その後、ウェル内のすべての製品は、プレートの底にあることを保証するために1分間500rpmでプレートを遠心する。 </li><li>遠心分離に続いて、プレートの底には氷や水がないことを確認してください。最後に、定量RT - PCRマシンにプレートを配置し、PCRプログラムを実行します。 </li></ol>実験のV.模式図<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：遺伝子発現研究のためのステップの順序を示すフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：中央に中腸を示す）幼虫のEABの解剖。幼虫のEABのB）孤立の中腸<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：）キューティクル（銅）、中腸（MG）と脂肪体（FB）を含むさまざまな幼虫組織におけるperitrophin遺伝子（AP - PERI1）の相対式の値を（回転数）を意味します。 EAB特定のリボソームタンパク質は、（ここに名前、AP - RP1）目的の遺伝子、AP - PERI1ために得られたデータを正規化するための内部コントロールとして使用した。幼虫の組織中のAP - PERI1のB）相対倍に変化。キューティクル組織は、少なくとも発現を示し、したがって、校正器（1X）のサンプル（Pfaffl、2001）とした。 <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：）幼虫の齢期（第1、第2、第3および第4）、prepupae（PP）および成人（）を含むEABの異なる発達段階におけるperitrophin遺伝子（AP - PERI1）の相対式の値を（回転数）を意味します。 EAB特定のリボソームタンパク質（AP - RP1）が目的の遺伝子、AP - PERI1ために得られたデータを正規化するための内部コントロールとして使用した。 B）様々な発達段階におけるAP - PERI1の相対倍の変化が。 PPのサンプルは、mRNAレベルの最低水準を示したため、キャリブレーター（1Xサンプル）とした。 VI。結論定量リアルタイムPCR（定量RT - PCR）が異なる昆虫の組織と発達段階にmRNAレベルを診断する有効なツールです。さらに、定量RT - PCRは、主にマイクロアレイと新世代のRNA - seqのようなハイスループット遺伝子発現解析から生成されたデータを検証するために重要なツールとなっています。

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

閾値サイクル（Ct値）の値は、定量RT - PCRプレートに各サンプルについて得られる。標準曲線を作成するために、各希釈液について得られたCt値は、その濃度の対数に対してプロットした。実験サンプルのCt値は、この希釈系列の標準曲線にプロットした。目標量は、それぞれの実験、すなわち組織や発生過程での発現用に生成された別々の標準曲線から計算した。相対式の値は、（回転）し、内部統制のために得られる量（AP - RP1）に関心の標的配列の量を（この場合AP - PERI1で）で割ることにより決定された。重要性の計算には、各遺伝子の回転数のログは、SAS（SASインスティチュート（株）SAS / STATユーザーガイド、バージョン9.1）のPROC MIXEDプロシージャを使用して、ANOVA（分散分析）により分析した。発現レベルの有意性はp &lt;0.05で測定した。組織の場合の相対的な倍の変化は、キャリブレーター（1Xサンプル、Pfaffl、2001）とキューティクルのサンプルをとることにより算出した。そのため、中腸および脂肪体での発現レベルは、キューティクルへの相対いた。発生過程での発...

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- pcr

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

エメラルド灰のボーラー（EAB、<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;）灰の木々の何百万人を殺してエキゾチックな侵襲的な害虫であり、（<em&gt;アオダモ</em北米で&gt;属）。<strong&gt;</strong&gt; EABは、急速に普及し続け、成熟した木々の苗木から、さまざまな年齢の灰の木を攻撃する。しかし、非常にほとんど、あるいはまったく分子知識がEABのために存在する日付に。私たちは、灰の木々の成功した植民地化の援助のEABという組織レベルでの分子ベースの生理学的プロセスを解読することに興味がある。本報告書では、別の幼虫組織における把握するmRNAのレベルまで定量的リアルタイムPCR（定量RT - PCR）（中腸、脂肪体とキューティクルを含む）と1を含むさまざまな発達段階（の効果的な使用方法を示して<sup&gt; ST</sup&gt; - 、2<sup&gt; ND</sup&gt; - 、3<sup&gt; RD</sup&gt; - 、4<sup&gt;目</supEABの&gt; -齢期、prepupaeと大人）。例として、peritrophinの遺伝子（ここに名前、<em&gt; AP - PERI1</em&gt;）は、目的の遺伝子とリボソームタンパク質（のように例示されている<em&gt; AP - RP1</em&gt;）内部統制として。 Peritrophinsは昆虫腸の粘膜であるperitrophic膜/マトリクス（PM）、の重要なコンポーネントです。 PMは、消化と腸上皮への機械的保護を含む多様な機能を備えています。

定量リアルタイムPCR（定量RT - PCR）が異なる昆虫の組織と発達段階にmRNAレベルを診断する有効なツールです。このレポートでは、異なる幼虫の組織や侵襲的な昆虫種の発達段階で把握するmRNAのレベルまで定量RT - PCRの使用、エメラルド灰ボーラーを示す。

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

アッシュボア（Emerald ash borer; EAB, *Agrilus planipennis*）は外来侵入害虫であり、北米で数百万本のトネリコ属（*Fraxinus* spp）の樹木を枯死させてきた。EABは…

本実験の全体的な目的は、定量PCRを用いて、エメラルドアッシュボアの組織および発生段階における遺伝子発現を解析することです。これは、幼虫組織の解剖および発生段階の分類によって達成されます。第二段階として、トリゾール試薬を用いて組織および発生段階からRNAを抽出し、それをテンプレートとして第1ストランドcDNAを合成します。第1ストランドcDNAの合成後、定量RT-PCRを実施します。サイクル閾値から得られた全変化データに基づき、さまざまな幼虫組織および発生段階における標的遺伝子の差分的発現を示す結果が得られます。定量的なR-T-P-C-R増幅後となります。こんにちは、オハイオ州立大学昆虫学科でこの研究室の責任者を務めているPrakash Miです。当研究室では主に、エメラルド・アッシュ・ボーラー（EAB）とトネリコの相互作用におけるゲノム的および分子的な側面に焦点を当てています。エメラルド・アッシュ・ボーラー（EAB）は中国原産の外来侵入害虫であり、北米全域のトネリコ個体群の存続を脅かしています。本日は、qPCR（定量リアルタイムPCR）を用いたEABにおける遺伝子発現解析の手法について解説します。このプロトコルに携わる研究室のメンバーは、valの解剖を行うSwapna pri ou、RNA分離を示すBin Bandari、そして最後にqPCR解析を担当するLauren Rivera Vegaです。また、当研究室ではこの手順を用いて、ashの遺伝子発現を研究しています。それでは、開始しましょう。この手順を始める前に、エメラルド-アッシュ-ボーラー（emerald ash B）またはEAD幼虫を湿らせたティッシュペーパーの上に置きます。解剖が行われるまで、解剖中のバッファーの低温を維持するため、調製したばかりの1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を氷上で保持しておきます。まず、解剖プレート上のEAB幼虫を細い解剖ピンで固定します。次に、解剖プレートに冷えた1×PBSを加えます。最初に、細い解剖用はさみを用いて幼虫の脱頭を行います。続いて、時計職人用ピンセットを用いて、幼虫の最後腹節を除去します。幼虫の死骸からクチクラを持ち上げ、その後、はさみを用いて死骸の長手方向に切開します。この際、腸管を破裂させないように注意してください。切開しながら、中腸組織を脂肪体や結合組織などの他の組織から慎重に分離します。次に、脂肪体の混入がないことを確認するため、新鮮な1×PBS緩衝液で組織を洗浄します。中腸を、1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れた500 µLの冷却済みTRIzol試薬に移します。次に、ピンセットを用いて脂肪体組織を単離し、500 µLの冷却したTRIzol試薬が入った1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。最後に、付着している組織を掻き取ることで、幼虫の死骸からクチクラ組織を単離します。その際、組織の完全性を損なわないよう注意してください。単離した角質組織を新鮮なPBSバッファーで洗浄し、500 µLの冷却したトリアゾール試薬が入った1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。単離した脂肪体、角質、および中腸組織は、RNA抽出まで-80 °Cで保存可能です。RNA抽出の準備として、さまざまなEABサンプルを発育段階に従って分類します。これらのステージには、星状体における第1、第2、第3、第4段階、およびPrepUと成体が含まれます。RNA抽出を開始するには、まずプラスチック製ペッスルを用いて、1.5 mLのTRIzolを含むチューブ内で組織を均質化します。均質化後、TRIzol試薬を用いて各サンプルの全量を1 mLにします。発生段階のサンプルの場合、個体全体を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いてホモジナイズします。次に、ホモジネートの分注量を1 mLのトリオールに加えます。サンプルチューブを1 mLのトリオールと共に、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、各チューブに200 µLのクロロフォームを直ちに加えます。チューブを約15秒間激しく振ってください。その後、室温でさらに2〜3分間インキュベートします。次に、サンプルを12,000 Gで15分間、2 °Cで遠心分離します。遠心分離後、RNAは水層に回収されます。水層の容量は600 µL、または全トリゾール量の60%にする必要があります。水相のみを慎重に除去します。水相の下に物質が残っていると、抽出されたRNAが汚染される原因となります。その後、水相を適切にラベルを貼った1.5 milliliterのエッペンチューブに移します。水相混合物からRNAを沈殿させるため、各チューブに0.5 millilitersのイソプロパノールを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを2 °Cで12,000 Gsにて10分間遠心分離します。遠心分離後、チューブからS natinを除去します。RNAは、チューブの底に形成されたゲル状のペレットの中に存在しています。ペレットを75% ethanolで洗浄します。混合液1 mLに対して少なくとも1 mLの75% ethanolを加え、ボルテックスで混合してください。その後、チューブを2°Cで7,500 Gにて5分間遠心分離します。チューブから上澄み液を除去します。小型卓上遠心機でチューブを再度1分間遠心分離します。ピペッティングを用いて慎重に、チューブ内の余分な上澄み液を取り除きます。チューブを開けたままにし、ペレットを5～10分間自然乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎると、自然乾燥後の溶解性が著しく低下するため注意してください。その後、ジエチルパーカボネートまたはDEPC処理水でペレットを再懸濁します。ペレットの再懸濁に使用する水の量は、ペレットの大きさに応じて異なります。小さいペレットの場合は50 µLのdep sea処理水を使用し、大きいペレットの場合は100 µLを使用してください。ピペットチップを数回上下に動かし、ペレットをdep sea処理水に完全に溶解させます。ペレットが溶解した後、サンプルを55°Cで10分間保持します。次に、NanoDrop分光光度計を用いて各RNAサンプルの濃度を測定します。最後に、Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis Systemを用いて、各RNAサンプルのRT-PCR用第一鎖cDNA合成を行います。この手順は、本プロトコルの記述部分で確認できます。定量リアルタイムPCR（Q-R-T-P-C-R）を開始するには、各プライマーの融解温度を60 °C、産物サイズを約100 bpに設計します。本実験では、目的遺伝子としてAP par oneを使用します。後の解析およびデータの標準化のために、リファレンス遺伝子または内部コントロールが必要です。ここでは、リボソームタンパク質 RPL1をリファレンス遺伝子として使用します。次に、各ウェルのサンプル名とQR-RT-PCRプレートを示すテンプレートを作成してください。各遺伝子の標準試料と、サンプルあたり少なくとも2つのテクニカルリプリケートを含めるようにしてください。次に、QRT-PCR機を起動し、CFX 96マシン用にプレートのサイクリングパラメータを入力して設定します。まず、各ウェル用に、各遺伝子のマスターミックスを個別のチューブで調製します。マスターミックスは、ヌクレアーゼフリー水 2 µL、2.5 x SYBR Green 4 µL、フォワードプライマー 1 µL、およびリバースプライマー 1 µLで構成され、合計容量は 8 µL となります。あらかじめ設計したテンプレートに従い、各ウェルに cDNA 2 µL を加えます。その後、各ウェルにマスターミックス 8 µL を加えることで、1反応あたりの合計容量を 10 µL とします。ピペッティングを行い、サンプルが十分に混ざっていることを確認してください。チップに液が残っていないことを確認します。クロスコンタミネーションを避けるため、サンプルごとに新しいチップを使用してください。プレート全体の準備が完了したら、オプティカルテープでプレートを密閉します。油脂が付着すると読み取りに影響を及ぼす可能性があるため、テープに触れないようにしてください。次に、プレートを500 RPMで1分間遠心分離し、ウェル内のすべての産物がプレートの底部に集まっていることを確認します。プレートの底に氷や水が付着していないかを確認してください。最後に、プレートをQR TPCR機にセットし、幼虫のEABに代表的なPCRプログラムを実行します。ここでは、解剖とQR TPCRの手順を示しています。EAB幼虫の解剖では、幼虫の中央に中腸が確認されるはずです。ここに示すように、EAB幼虫の中腸を単離し、平均相対発現量（RAV）を算出しました。パラトロフィン遺伝子AP par oneについて、クチクラ、中腸、脂肪体を含む異なる幼虫組織での発現量がここに示されています。目的遺伝子のデータ正規化のための内部標準として、EAB特異的リボソームタンパク質ARP oneを使用しました。異なる幼虫組織におけるAP Perry 1の相対的なフォールド変化を抽出しました。クチクラ組織の発現量が最も低かったため、1齢、2齢、3齢、および4齢を含むEABの異なる発育段階におけるAP Perry 1の校正サンプル平均RVとして使用しました。PrepUおよび成体における定量では、データの標準化のためにaprp oneを内部標準として用いた。様々な発生段階におけるAP Perry oneの相対的な倍率変化を測定した。ここでは、PrepUサンプルにおいてmRNAレベルが最も低かったため、これをキャリブレーターとして採用した。ここでは、側方解剖の方法と、それに続き、定量的R-T-P-C-Rを用いて側方組織およびEmeral raのさまざまな発生段階の遺伝子発現解析を行う手順を説明しました。解剖の際は、組織サンプルが交差汚染されないよう注意してください。また、Q-R-T-P-C-Rを実施する際は、それぞれのサンプルを対応するPCRウェルにピペッティングするよう細心の注意を払ってください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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