エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

本実験の全体的な目的は、定量PCRを用いて、エメラルドアッシュボアの組織および発生段階における遺伝子発現を解析することです。これは、幼虫組織の解剖および発生段階の分類によって達成されます。第二段階として、トリゾール試薬を用いて組織および発生段階からRNAを抽出し、それをテンプレートとして第1ストランドcDNAを合成します。第1ストランドcDNAの合成後、定量RT-PCRを実施します。

サイクル閾値から得られた全変化データに基づき、さまざまな幼虫組織および発生段階における標的遺伝子の差分的発現を示す結果が得られます。定量的なR-T-P-C-R増幅後となります。こんにちは、オハイオ州立大学昆虫学科でこの研究室の責任者を務めているPrakash Miです。

当研究室では主に、エメラルド・アッシュ・ボーラー（EAB）とトネリコの相互作用におけるゲノム的および分子的な側面に焦点を当てています。エメラルド・アッシュ・ボーラー（EAB）は中国原産の外来侵入害虫であり、北米全域のトネリコ個体群の存続を脅かしています。本日は、qPCR（定量リアルタイムPCR）を用いたEABにおける遺伝子発現解析の手法について解説します。

このプロトコルに携わる研究室のメンバーは、valの解剖を行うSwapna pri ou、RNA分離を示すBin Bandari、そして最後にqPCR解析を担当するLauren Rivera Vegaです。また、当研究室ではこの手順を用いて、ashの遺伝子発現を研究しています。

それでは、開始しましょう。この手順を始める前に、エメラルド-アッシュ-ボーラー（emerald ash B）またはEAD幼虫を湿らせたティッシュペーパーの上に置きます。解剖が行われるまで、解剖中のバッファーの低温を維持するため、調製したばかりの1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を氷上で保持しておきます。

まず、解剖プレート上のEAB幼虫を細い解剖ピンで固定します。次に、解剖プレートに冷えた1×PBSを加えます。最初に、細い解剖用はさみを用いて幼虫の脱頭を行います。

続いて、時計職人用ピンセットを用いて、幼虫の最後腹節を除去します。幼虫の死骸からクチクラを持ち上げ、その後、はさみを用いて死骸の長手方向に切開します。この際、腸管を破裂させないように注意してください。

切開しながら、中腸組織を脂肪体や結合組織などの他の組織から慎重に分離します。次に、脂肪体の混入がないことを確認するため、新鮮な1×PBS緩衝液で組織を洗浄します。中腸を、1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れた500 µLの冷却済みTRIzol試薬に移します。

次に、ピンセットを用いて脂肪体組織を単離し、500 µLの冷却したTRIzol試薬が入った1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。最後に、付着している組織を掻き取ることで、幼虫の死骸からクチクラ組織を単離します。その際、組織の完全性を損なわないよう注意してください。

単離した角質組織を新鮮なPBSバッファーで洗浄し、500 µLの冷却したトリアゾール試薬が入った1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。単離した脂肪体、角質、および中腸組織は、RNA抽出まで-80 °Cで保存可能です。RNA抽出の準備として、さまざまなEABサンプルを発育段階に従って分類します。

これらのステージには、星状体における第1、第2、第3、第4段階、およびPrepUと成体が含まれます。RNA抽出を開始するには、まずプラスチック製ペッスルを用いて、1.5 mLのTRIzolを含むチューブ内で組織を均質化します。均質化後、TRIzol試薬を用いて各サンプルの全量を1 mLにします。

発生段階のサンプルの場合、個体全体を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いてホモジナイズします。次に、ホモジネートの分注量を1 mLのトリオールに加えます。サンプルチューブを1 mLのトリオールと共に、室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、各チューブに200 µLのクロロフォームを直ちに加えます。チューブを約15秒間激しく振ってください。その後、室温でさらに2〜3分間インキュベートします。

次に、サンプルを12,000 Gで15分間、2 °Cで遠心分離します。遠心分離後、RNAは水層に回収されます。水層の容量は600 µL、または全トリゾール量の60%にする必要があります。

水相のみを慎重に除去します。水相の下に物質が残っていると、抽出されたRNAが汚染される原因となります。その後、水相を適切にラベルを貼った1.5 milliliterのエッペンチューブに移します。

水相混合物からRNAを沈殿させるため、各チューブに0.5 millilitersのイソプロパノールを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを2 °Cで12,000 Gsにて10分間遠心分離します。遠心分離後、チューブからS natinを除去します。

RNAは、チューブの底に形成されたゲル状のペレットの中に存在しています。ペレットを75% ethanolで洗浄します。混合液1 mLに対して少なくとも1 mLの75% ethanolを加え、ボルテックスで混合してください。その後、チューブを2°Cで7,500 Gにて5分間遠心分離します。

チューブから上澄み液を除去します。小型卓上遠心機でチューブを再度1分間遠心分離します。ピペッティングを用いて慎重に、チューブ内の余分な上澄み液を取り除きます。

チューブを開けたままにし、ペレットを5～10分間自然乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎると、自然乾燥後の溶解性が著しく低下するため注意してください。その後、ジエチルパーカボネートまたはDEPC処理水でペレットを再懸濁します。

ペレットの再懸濁に使用する水の量は、ペレットの大きさに応じて異なります。小さいペレットの場合は50 µLのdep sea処理水を使用し、大きいペレットの場合は100 µLを使用してください。ピペットチップを数回上下に動かし、ペレットをdep sea処理水に完全に溶解させます。

ペレットが溶解した後、サンプルを55°Cで10分間保持します。次に、NanoDrop分光光度計を用いて各RNAサンプルの濃度を測定します。最後に、Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis Systemを用いて、各RNAサンプルのRT-PCR用第一鎖cDNA合成を行います。

この手順は、本プロトコルの記述部分で確認できます。定量リアルタイムPCR（Q-R-T-P-C-R）を開始するには、各プライマーの融解温度を60 °C、産物サイズを約100 bpに設計します。本実験では、目的遺伝子としてAP par oneを使用します。

後の解析およびデータの標準化のために、リファレンス遺伝子または内部コントロールが必要です。ここでは、リボソームタンパク質 RPL1をリファレンス遺伝子として使用します。次に、各ウェルのサンプル名とQR-RT-PCRプレートを示すテンプレートを作成してください。

各遺伝子の標準試料と、サンプルあたり少なくとも2つのテクニカルリプリケートを含めるようにしてください。次に、QRT-PCR機を起動し、CFX 96マシン用にプレートのサイクリングパラメータを入力して設定します。まず、各ウェル用に、各遺伝子のマスターミックスを個別のチューブで調製します。

マスターミックスは、ヌクレアーゼフリー水 2 µL、2.5 x SYBR Green 4 µL、フォワードプライマー 1 µL、およびリバースプライマー 1 µLで構成され、合計容量は 8 µL となります。あらかじめ設計したテンプレートに従い、各ウェルに cDNA 2 µL を加えます。その後、各ウェルにマスターミックス 8 µL を加えることで、1反応あたりの合計容量を 10 µL とします。ピペッティングを行い、サンプルが十分に混ざっていることを確認してください。

チップに液が残っていないことを確認します。クロスコンタミネーションを避けるため、サンプルごとに新しいチップを使用してください。プレート全体の準備が完了したら、オプティカルテープでプレートを密閉します。

油脂が付着すると読み取りに影響を及ぼす可能性があるため、テープに触れないようにしてください。次に、プレートを500 RPMで1分間遠心分離し、ウェル内のすべての産物がプレートの底部に集まっていることを確認します。プレートの底に氷や水が付着していないかを確認してください。

最後に、プレートをQR TPCR機にセットし、幼虫のEABに代表的なPCRプログラムを実行します。ここでは、解剖とQR TPCRの手順を示しています。EAB幼虫の解剖では、幼虫の中央に中腸が確認されるはずです。

ここに示すように、EAB幼虫の中腸を単離し、平均相対発現量（RAV）を算出しました。パラトロフィン遺伝子AP par oneについて、クチクラ、中腸、脂肪体を含む異なる幼虫組織での発現量がここに示されています。目的遺伝子のデータ正規化のための内部標準として、EAB特異的リボソームタンパク質ARP oneを使用しました。

異なる幼虫組織におけるAP Perry 1の相対的なフォールド変化を抽出しました。クチクラ組織の発現量が最も低かったため、1齢、2齢、3齢、および4齢を含むEABの異なる発育段階におけるAP Perry 1の校正サンプル平均RVとして使用しました。

PrepUおよび成体における定量では、データの標準化のためにaprp oneを内部標準として用いた。様々な発生段階におけるAP Perry oneの相対的な倍率変化を測定した。ここでは、PrepUサンプルにおいてmRNAレベルが最も低かったため、これをキャリブレーターとして採用した。

ここでは、側方解剖の方法と、それに続き、定量的R-T-P-C-Rを用いて側方組織およびEmeral raのさまざまな発生段階の遺伝子発現解析を行う手順を説明しました。解剖の際は、組織サンプルが交差汚染されないよう注意してください。また、Q-R-T-P-C-Rを実施する際は、それぞれのサンプルを対応するPCRウェルにピペッティングするよう細心の注意を払ってください。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。