エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

本実験の全体的な目的は、定量PCRを用いて、エメラルドアッシュボアの組織および発生段階における遺伝子発現を解析することである。これは、幼虫組織の解剖と発生段階の分類によって行われる。次のステップとして、トリゾール試薬を用いて組織および発生段階からRNAを抽出し、これを鋳型として第1鎖cDNAを合成する。第1鎖cDNAの合成後、定量RT-PCRを実施する。

サイクルしきい値から得られた全変動データに基づき、さまざまな幼虫組織および発生段階における標的遺伝子の差分的発現を示す結果が得られます。これは定量RT-PCR増幅後の結果です。こんにちは、オハイオ州立大学昆虫学部のこの研究室の責任者であるPrakash Miです。

私の研究室では主に、エメラルド・アッシュ・ボアラー（EAB）とアッシュ（トネリコ）の相互作用におけるゲノムまたは分子レベルの側面に焦点を当てて研究しています。エメラルド・アッシュ・ボアラー（EAB）は中国原産の外来侵入害虫であり、北米全域のアッシュ個体群の存続を脅かしています。本日は、qPCR（定量リアルタイムPCR）を用いたEABの遺伝子発現解析を学ぶためのプロトコルをご紹介します。

本プロトコルに携わる研究室のメンバーは、valの解剖を行うSwapna pri ou、RNA抽出を実演するbin Bandari、そして最後にqPCR解析を行うLauren Rivera Vegaです。また、当研究室ではこの手順を用いて、ashの遺伝子発現についても研究しています。

それでは開始しましょう。この手順を始める前に、エメラルドアッシュボア（EAB）の幼虫を湿らせたティッシュペーパーの上に置きます。解剖を行うまで、解剖の間ずっとバッファーを冷やしておくため、調製したばかりの1x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を氷上に保持してください。

まず、EAB幼虫を細い解剖ピンで解剖皿に固定します。次に、冷やした1×PBSを解剖皿に加えます。そして、先の細い解剖用はさみを用いて、幼虫の頭部を切除します。

続いて、時計用ピンセットを用いて幼虫の最後腹節を除去します。幼虫の死体から角質層を剥がし、その後、はさみを用いて死体の長手方向に切開します。この際、腸管を破裂させないよう注意してください。

切開を行いながら、中腸組織を脂肪体や結合組織などの他の組織から注意深く分離します。次に、脂肪体の混入がないように、組織を新鮮な1×PBSバッファーで洗浄します。中腸を、1.5 mLのエンドルフチューブに入れた、あらかじめ冷却した500 µLのTRIzol試薬に移します。

次に、ピンセットを用いて脂肪体組織を分離し、500 µLの冷却したTRIzol試薬が入った1.5 mLエッペンドルフチューブに移します。最後に、幼虫の死骸から、付着している組織を掻き取ることで角質組織を分離します。その際、組織の完全性を損なわないよう注意してください。

分離した角皮組織を新鮮なPBSバッファーで洗浄し、500 µLの冷却したトリアゾール試薬が入った1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。分離した脂肪体、角皮、および中腸組織は、RNA抽出まで-80 °Cで保存可能です。RNA抽出の準備として、さまざまなEABサンプルを発育段階に応じて分類します。

これらの段階には、星状体、PrepU、および成体における第1、第2、第3、第4段階が含まれます。RNA抽出を開始するには、まずプラスチックペッスルを使用して、1.5 mLのTRIzolを含むエッペンドルフチューブ内で組織を均質化します。均質化後、TRIzol試薬を用いて各サンプルの全量を1 mLに調整します。

発生段階の試料については、乳鉢と乳棒を用い、液体窒素中で個体全体をホモジナイズします。次に、ホモジネートの分注量を1 mLのトリオールに加えます。試料チューブを1 mLのトリオールと共に、室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、各チューブにクロロホルムを200 µL加えます。チューブを約15秒間激しく振ってください。その後、室温でさらに2〜3分間インキュベートします。

次に、サンプルを2 °Cで12,000 GS、15分間遠心分離します。遠心分離後、RNAは水層に回収されます。水層の容量は600 µL、または全トリオール容量の60%である必要があります。

水相のみを注意深く取り出します。水相の下に物質が残っていると、抽出したRNAが汚染される原因となります。その後、水相を適切にラベルを貼った1.5 milliliterのエッペンチューブに移します。

水相混合物からRNAを沈殿させるため、各チューブに0.5 millilitersのイソプロパノールを加えます。サンプルを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを2 °Cで12,000 Gsにて10分間遠心分離します。遠心分離後、チューブからS natinを除去します。

RNAはチューブの底に形成されたゲル状のペレット中に存在します。75% ethanolでペレットを洗浄します。その際、混合液1 mLあたり少なくとも1 mLの75% ethanolを加え、ボルテックスで混合してください。その後、チューブを2°Cで5分間、7,500 Gで遠心分離します。

チューブから上清を捨てます。小型卓上遠心機でチューブを再度1分間遠心分離します。ピペッティングにより、チューブ内の余分な上清を慎重に取り除きます。

チューブを開けたままにして、ペレットを5〜10分間自然乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎないように注意してください。乾燥させすぎると、自然乾燥後の溶解性が著しく低下します。ペレットをジエチルピロカルボナートまたはDEPC処理水で再懸濁します。

ペレットの再懸濁に使用する水の量は、ペレットの大きさに応じて異なります。ペレットが小さい場合は50 µLのdep sea treated waterを、大きい場合は100 µLを使用します。ピペットチップを数回上下に動かし、ペレットをdep sea treated waterに完全に溶解させてください。

ペレットが溶解した後、サンプルを55 °Cで10分間保持します。次に、NanoDrop分光光度計を用いて各RNAサンプルの濃度を測定します。最後に、Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis Systemを用いて、各RNAサンプルのRT-PCR用第一鎖cDNA合成を行います。

この手順は、本プロトコルの記述部分で確認できます。定量的リアルタイムPCR（Q-R-T-P-C-R）を開始するには、各プライマーの融解温度を60 °C、産物サイズを約100 base pairsとなるように設計します。本実験では、標的遺伝子としてAP par oneを使用します。

後の解析およびデータの標準化（ノーマライゼーション）には、参照遺伝子または内部コントロールが必要です。ここでは、リボソームタンパク質 a P RRP one を参照遺伝子として使用します。次に、各ウェルのサンプル名とQR tpcrプレートを示すテンプレートを作成します。

各遺伝子の標準試料と、サンプルあたり少なくとも2つのテクニカルリプリケートを含めることを忘れないでください。次に、qRT-PCR装置の電源を入れ、CFX 96装置でプレートをセットアップするためのサイクリングパラメータを入力します。まず、各ウェル用に個別のチューブを用いて、遺伝子ごとのマスターミックスを調製します。

マスターミックスは、ヌクレアーゼフリー水 2 µL、2.5 x CYBER Green 4 µL、フォワードプライマー 1 µL、およびリバースプライマー 1 µLで構成され、総量 8 µL となります。あらかじめ設計したテンプレートに従い、各ウェルに cDNA 2 µL を加えます。次に、各ウェルにマスターミックス 8 µL を加えると、1反応あたりの総量は 10 µL となります。ピペッティングを行い、サンプルが十分に混合されていることを確認してください。

チップに液体が残っていないことを確認します。クロスコンタミネーションを防ぐため、サンプルごとに新しいチップを使用してください。プレート全体のセットアップが完了したら、オプティカルテープでプレートを密封します。

油脂が付着すると測定値に影響を及ぼす可能性があるため、テープに触れないようにしてください。次に、プレートを500 RPMで1分間遠心分離し、ウェル内のすべての生成物がプレートの底に集まっていることを確認します。プレートの底に氷や水が付着していないことを確認してください。

最後に、プレートをQR TPCR装置にセットし、ヤングヤナギホシボソギス（EAB）幼虫の代表的な結果に対応するPCRプログラムを実行します。ここでは、解剖とQR TPCRの手順を示しています。EAB幼虫の解剖では、幼虫の中央にある中腸が露出しているはずです。

このようにしてEAB幼虫の中腸を単離します。ここで、平均相対発現値（RAV）を示します。パラトロフィン遺伝子AP par oneについて、外皮、中腸、脂肪体を含む異なる幼虫組織での発現をここに示します。目的遺伝子で得られたデータの正規化には、EAB特異的なリボソームタンパク質ARP oneを内部標準として使用しました。

異なる幼虫組織におけるAP AP par oneの相対的なフォールド変化を抽出しました。角質層組織で最も発現が低かったため、これを校正サンプル平均RVsとして、1齢、2齢、3齢、および4齢幼虫を含むEABの異なる発達段階におけるAP Perry oneに適用しました。

PrepUおよび成体のデータは、データの標準化のため、内部コントロールとしてaprp oneを用いて決定されました。様々な発生段階におけるAP Perry oneの相対的な倍率変化を算出しました。ここでは、PrepUサンプルが最も低いmRNAレベルを示したため、これをキャリブレーターとして採用しました。

以上で、側方解剖の手法と、それに続く定量的R-T-P-C-Rを用いた側方組織およびEmeral raの様々な発生段階における遺伝子発現解析の手順について説明しました。解剖を行う際は、組織サンプルが相互に混入しないよう注意してください。また、Q-R-T-P-C-Rを実施する際は、それぞれのサンプルを対応するPCRウェルに正しくピペッティングするように注意してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。