Name: ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ後脳の細胞標識と高解像度イメージング法。膜標的GFPを用いて単一細胞の形態と動態を可視化し、神経発生のメカニズム解明に貢献する。

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この作品は、R.ブリュースター（1R01GM085290 - 01A1）に授与されたNIHの助成金によって支えられている。

1.Microinjection <ol><li>希釈をコードするプラスミド膜をターゲットとした緑色蛍光タンパク質（MGFP、リチャードハーランドの礼儀）40 ng / mlの濃度に。 DNAはキアゲンのマキシプレップキットを使用して精製されたプラスミド（リチャードハーランドのmGFP/PCS2 +、礼儀）を線形化することによって調製される。ソリューションへのフェノールレッドの加算は、（総容積1 / 10に希釈）ソリューションを可視化することが好ましい。氷の上にDNA溶液を保管してください。 </li><li>累進的なスライドに針を合わせ、静かにきれいなかみそりを使用して直径が1μm以下である針の部分をタップすることで、実体顕微鏡下で、注射針を（カタログ番号NA - GD - 1 Narishinge科学から90ミリメートルのガラスキャピラリー）キャリブレーションブレード（適当な大きさの先端を得るために）。 </li><li>ピース上に配置フェノールレッドと水を含む溶液の0.5μlを使用してニードルを記入し、フロント、知られているボリューム（2nl）を注入する針を較正するために、マイクロインジェクション装​​置（ハーバード大学の装置PCI 100マイクロインジェクター）に針を接続パラフィンの。解決策は、フットペダルを使用して省略することができる。 7 kPaに圧力を設定し、それが解決策の0.5μlディスペンス、250ペダルを取るように（10ミリ秒30msec）に変わる。 </li><li>加湿100ミリメートルペトリ皿の中のワックスのストリップに校正針を慎重に置きます。料理を加湿するために、エッジの周りの湿ったキムワイプを（これは針で溶液の蒸発を防ぐ）に置きます。 </li><li>針の端（キャリブレーションされていないエンド）へのDNAの0.5〜1μlをロードするためにマイクロピペットを使用してください。 </li><li>ソリューションは、針の先端に達すると、マイクロインジェクション装​​置にロードするために使用された針の端を接続します。フットペダルを使用して約2 NL /注入を実現するためにインジェクターの設定を調整します。 </li><li>胚の培地（1.0ミリリットルハンクス証券第1位、0.1ミリリットルハンクの株式＃2、1.0ミリリットルハンクの証券第4位で満たされたペトリ皿の中央にある次の、位置のゼブラフィッシュの胚、95.9ミリリットルのddH 2 O、1.0ミリリットルハンクス証券第5位、1.0 mlの新鮮なハンクの株式＃6、pH7.2に約10滴1 M NaOHを使用してください）​​。 </li><li>胚が目的の段階に開発が完了したら、軽く細かい鉗子で絨毛膜をつまんで、注射の対象となる領域に針を位置づける。広い範囲のMGFP式の場合は、卵黄または1セルの段階で細胞質にDNAを注入する。小さい領域にMGFPの発現を制限するには、単一のセルの細胞質中に4（またはそれ以上）の細胞の段階でDNAを注入する。 </li><li>マイクロインジェクション装​​置のフットペダルを押すと、約2 NLを提供する、ソリューション（フェノールレッドの添加による目に見える）が適切に注入されることが保証されます。 </li><li>慎重に胚から針を取り除く。 </li><li>ペトリ皿内のすべての胚について繰り返します。 </li><li>胚は28.5で、目的の段階に° Cを開発することができます。 </li><li>優しく細かい鉗子を（胚は、胚の生存率を増加させるガラスシャーレにdechorionating、24hpf未満である場合）を使用して絨毛膜を剥離することによりDechorionate胚。 </li><li>ガラスピペットを用いてペトリ皿から空の絨毛膜を取り外します。 </li></ol> 2。イメージングMGFP標識ビブラトームセクション<ol><li> 1Xリン酸緩衝液（PBS）で固定液（4％パラホルムアルデヒドに胚を輸送するためにガラスのピペットを使用してください。4℃で一晩胚を修正しました。 </li><li>各5分間、1 × PBSで3回の胚を洗浄してください。 </li><li>シャーレに胚を置くと、微細な鉗子を用いて、胚を損なうことなく、卵黄を削除します。できる限り多くの卵黄を削除します。 </li><li> H 2 Oで4％低融点アガロースを準備する</li><li>プラスチック切片金型内に溶融アガロースを置きます。 </li><li>ペトリ皿から注入された胚を持ち上げ、アガロース内の場所と向きにするために微細な鉗子を使用してください。胚は、金型の一方の端に向かって配置する必要があります。 </li><li>アガロースが硬化されると、金型からアガロースブ​​ロックを削除するには、そのようなヘラのように、平面のツールを使用してください。 </li><li>それが偶数になるようにかみそりの刃を持つアガロースブ​​ロックの下端をカット。 </li><li>ビブラトーム舞台にスーパー接着剤のドロップを追加し、その上にアガロースブ​​ロック（剃刀で横ばいしたブロックの側面に接着剤を直視しなければならない）を置きます。複数の胚を切片の場合は、ステージ上にいくつかのアガロース包埋標本をマウント。 </li><li>ビブラトーム（ビブラトーム社）にビブラトームステージを取り付けます。 </li><li>ビブラトームのパラメータを設定します（一般的な設定：速度-3、厚さ50μmの）。複数の胚をセクショニングの場合、ステージ上でアガロースブ​​ロックを合わせ、ブレードの全胚経由ではなく、アガロースブ​​ロック（同じ胚に対応するセクションが一緒に残ることなど）の全体幅を通過することを確認してください。 </li><li>ビブラトーム段階での1X PBSを注ぐ。 </li><li>セクション。 </li><li>胚は、切開されるとNED、ビブラトーム段階からアガロースブ​​ロック（複数可）を削除します。 </li><li>慎重にアガロースブ​​ロック（複数可）の後ろを切断することにより、各セクションを区切ります。 </li><li> 1X PBSを充填したマルチウェルディッシュ（別の胚に対応するセクションに別の井戸を使用）に必要なセクションと場所を選択するために微細な鉗子を使用してください。 </li><li>各胚について、この手順を繰り返します。 </li><li>抗体標識を続行、MGFPイメージング（セクションは準備の一日か二日以内にイメージングされた場合は、この手順が不要な場合もあります）高めるために、23も19を繰り返します。 </li><li>非特異的結合をブロックするために1 × PBSでブロッキング溶液で、室温で30分間のセクションを扱います。 </li><li>一次抗体（ウサギA - GFP、Invitrogen社カタログ番号A11122）4、5、室温で数時間または一晩シェーカー上でブロッキング溶液で@ 1:200に希釈℃の切片をインキュベートします</li><li> 4回（10分、15分、30分および60分、各）1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液で洗浄する。 </li><li> 4℃、室温または一晩で5時間ブロッキング溶液に適当な二次抗体を持つセクションを扱う℃に</li><li> 4回（10分、15分、30分および60分、各）1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液で洗浄する。 </li><li>核を染色するために30分間、DAPI（Invitrogen社カタログ番号D1306 50ミリリットル1X PBSで0.1％DAPI）を使用してセクションを扱う。 </li><li> 5分間ずつ1X PBSで3回洗浄する。 </li><li>スライド上にマウントします。 </li><li>共焦点顕微鏡を使用してイメージ。 </li></ol> 3。ライブイメージング<ol><li>ライブDechorionate、それらが所望の発達段階に到達する30分前に胚を注入した。 15分間鎮静剤溶液中での胚（胚の培地中0.01％Tricaine）を置きます。 </li><li> （;品番P35G - O - 20 - Cマテック）35ミリメートルのガラス底の培養皿上に1％アガロースの低下を置きます。 </li><li>アガロースを固化することができます。 </li><li>アガロースの3つの穴を（そのようなマイクロピペットの先端のような他のオブジェクトは穴を作るために使用されることがあります）ように炎上熱毛細管。残存アガロースは、穴の底ではないことを確認してください。 </li><li>胚培地でシャーレを埋める。 </li><li>穴に胚を配置するガラスピペットを使用してください。 </li><li>次に、オリエント胚は（背側頭部）の領域がイメージを作成するように微細な鉗子を使用して、ガラスと接触している。 </li><li>注意深く顕微鏡ステージ（蒸発を防ぐために、ペトリ皿上に蓋を置く）にペトリ皿を運ぶ。 </li><li>イメージングしながら、胚は℃、28.5になっていることを確認してください</li></ol> 4。結果ここでは、モザイクの表現を用いてゼブラフィッシュ神経管の画像単一細胞への直接的なアプローチを説明します。ゼブラフィッシュ胚の光透過性にもかかわらず、我々は神経細胞の可視化が大幅にビブラトームを用いて得られた断面に増強されることを見出した。これらのセクションでは、共焦点顕微鏡を用いて異なる焦点面内の特定の細胞から細胞の拡張子のイメージングを可能にする（50 mm）の厚さです。この方法論を使用して結果を別の場所で2公開されているが、WT胚（図1）とN -カドヘリン（N - CAD）変異体（図2）の神経管の細胞の代表的な画像が提供されています。後者は、N - CADの変異体は正中線（図2）に向けて適切に方向付けるために失敗に神経板の外側の領域でその細胞を明らかにする。このモザイクのラベリングとは対照的に、このようなβ-カテニンなどの一般的な細胞表面マーカーと上皮を免疫染色すると、個々の細胞の形態は（図3）可視化することはできません。 ライブ胚のタイムラプスイメージングが神経胚形成の間に起こる細胞のダイナミクスの理解を可能にする、固定標本のモザイクのラベルを補完。ムービー1はWT細胞が積極的に内方に向いた膜の突起を拡張することで、正中線に向かって移行することを明らかにした。 <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> WTゼブラフィッシュ胚の神経管に図1。MGFP式。 <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> N -カドヘリンのゼブラフィッシュ胚の神経管2。MGFP式図 。 <img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 神経上皮の図3。B -カテニン免疫染色。

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).</li>
<li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

結論では、標識技術は、ゼブラフィッシュ胚における形態形成のプロセスの単一細胞の分析を可能にするここで説明する。このプロトコルの主な重点は、ユビキタスプロモーターの制御下MGFPを使用して、神経管のイメージング標識細胞のための方法になります。この一過性発現アッセイのリーダーの追加のアプリケーション用にアンデルセンらによる最近の論文を参照する必要があります。3。

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Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

ソリューション<ul><li>ハンクの株式第1位：8.0グラムのNaClを100ml DD H 2 Oで0.4グラムのKCl </li><li>ハンクの株式＃2：0.358グラムのNa 2 HPO 4、無水、100ミリリットルのddH 2 Oで0.60グラムのKH 2 PO 4 </li><li>ハンクの証券第4位：50ミリリットルのddH 2 Oで0.72グラムのCaCl 2 </li><li>ハンクの株式第5位：50ミリリットルDD H 2 Oで1.23グラムのMgSO 4 x7H 2 O </li><li> 1 Xリン酸緩衝液：0.8％のNaCl、0.02％のKCl、0.02 M PO4、pH7.3に</li><li>ブロッキング溶液：2％正常ヤギ血清、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1％dimethysulfoxide（DMSO） </li></ul>

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

初期の脊椎動物の胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ゼブラフィッシュ胚、モザイク式の中のプラスミドDNAの結果の注入は、単一の細胞または細胞の小さなクラスターの可視化を可能に<sup&gt; 1</sup&gt;。我々は、ユビキタスプロモーターの制御下でプラスミドDNAのエンコーディング膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質（MGFP）の注入は神経胚形成を受けているイメージング細胞に使用できる方法について説明します。このプロトコルの中心は、セクションでもリアルタイムで高分解能でイメージング標識された細胞のための方法論です。このプロトコルは、若いゼブラフィッシュ胚にMGFPのDNAの注入を必要とする。胚はその後ビブラトーム切片、抗体標識と共焦点顕微鏡によるイメージングのために処理されます。また、MGFPを表現するライブ胚をタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて画像化することができます。我々は以前、ゼブラフィッシュ胚の後脳領域で神経管の形成を駆動する細胞の挙動を分析するためにこの簡単なアプローチを使用している<sup&gt; 2</sup&gt;。ライブイメージングは​​、神経胚形成の間に起こる細胞のダイナミクスの理解を可能にするこのアプローチを補完しながら神経管の細胞の形状や組織の前例のない可視化のために許容される固定の準備。

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。

初期の脊椎動物胚を形成する形態形成プロセスの理解において鍵となるのは、細胞を高解像度でイメージングできる能力である。ゼブラフィッシュにおいて...

本実験の全般的な目的は、ゼブラフィッシュ胚における神経細胞を高解像度でイメージングすることです。まず、膜標的型緑色蛍光タンパク質をコードするDNAをゼブラフィッシュの1細胞期胚に注入します。これによりモザイク状の継承が起こり、分散した細胞の高感度なイメージングが可能になります。次に、胚を抗GFP抗体で免疫染色し、切片を作成することで、固定標本における単一細胞の形態を高解像度で可視化します。あるいは、タイムラプスビデオ顕微鏡を用いて生存胚を観察し、細胞のダイナミクスをイメージングすることも可能です。細胞の形態やダイナミクスを示す結果が得られます。ここでは、共焦点顕微鏡を用いてゼブラフィッシュの後脳をイメージングします。皆さん、こんにちは。私は、メリーランド大学ボルチモア郡校生物科学科のRachel Brewster博士の研究室に所属しているPR Chandranです。本日は、ゼブラフィッシュ胚の神経細胞を高解像度でラベル化し、イメージングする手法をご紹介します。私たちは通常、この手法を研究室で用い、ゼブラフィッシュ胚における神経系の形成メカニズムを細胞レベルで研究しています。それでは始めましょう。100 mmのペトリ皿の縁に、濡らしたキムワイプを配置します。加湿したディッシュ内のワックスストリップに、ガラスマイクロインジェクション針を慎重に固定します。解剖用実体顕微鏡下で、針を目盛り付きのスライドガラスに合わせて調整します。適切なサイズの先端を得るために、清潔なカミソリの刃を使用して、針の直径が1 µmである箇所を軽く叩きます。針をマイクロインジェクション装置に接続します。フェノールレッド水溶液を0.5 µL、パラフィルム上に滴下し、その液滴から針へフロントフィル（前方充填）を行います。マイクロインジェクションの圧力を7 kPaに設定し、まずは20 msのパルスで開始してください。すべての液体を分注するのに必要なパルス数をカウントします。分注に約250パルスかかるように、パルス時間を10 msから30 msの間で調整してください。0.5 µLの溶液。マイクロピペットを用いて、可視化のためにフェノールレッドを混合した水溶性のMG FPD NAを0.5〜1 µL、針に逆充填します。実体顕微鏡下で、針内から溶液が蒸発するのを防ぐため、加湿ディッシュに蓋をします。1細胞期の魚類胚を、胚培養液を満たした60 mmのペトリ皿に個別に配置します。細いピンセットを用いてコリアンをそっと掴み、胚を固定します。MGFPとフェノールレッドを満たした針を、注入対象部位まで移動させます。広範囲にMGFPを発現させるには、卵黄または細胞質に注入します。マイクロインジェクション装置を用いて、約2 nanolitersのMGFP溶液を注入してください。フェノールレッド指示剤の位置を確認し、適切に注入されたことを確かめます。胚から針を慎重に抜きます。ディッシュ内の胚を、一度に最大30個まですべて注入します。胚が光にさらされないように注意し、実体顕微鏡下で、胚が目的の段階まで発育するよう28.5 °Cでインキュベートします。精細ピンセットを用いて、胚からコリオンをそっと剥がします。パスタピペットを使用して、空のコリオンをディッシュから取り除き、DECでコートした胚のみを残します。火で先端を処理したパスタピペットを使用して、注入済みのコート胚を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。余分な培地をできる限り取り除き、ativeを1 mL加えます。胚を室温の1X PBSで5分間ずつ3回洗浄します。実体顕微鏡下で、胚を1X PBSを満たしたシャーレに移動させます。精密ピンセットを使用して、胚の尾部付近を保持します。2組目のピンセットまたはポーカーを用い、後方フレーム領域に触れないように注意しながら、可能な限り多くの卵黄を除去します。実体顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて胚をディッシュから持ち上げ、4%低融点アガロースを満たした切断用モールドに入れます。胚をモールドの端に配置します。アロスを室温で凝固させます。スパチュラを使用して、硬化したアロスブロックをモールドから取り出し、カミソリの刃でブロックの底端を均等に切り落とします。必要に応じて、瞬間接着剤を1滴使用し、ブロックの切断面を下にしてバイブレーターステージに固定します。ステージ上に複数のブロックを並べて配置します。ステージをバイブレーターに取り付けます。ブレードが各胚を完全に切断し、かつブロックまで完全に切り抜けないようにしてください。ステージにXPBSを1セクション分満たします。胚をブロックの背面まで慎重に切り出し、XPBSを満たしたペトリ皿に移します。実体顕微鏡下で切片を分離します。微小ピンセットを使用して、目的の切片を1x PBSを満たしたマルチウェルディッシュに移します。胚ごとに異なるウェルを使用してください。切片をDPIで染色し、抗GFP抗体で免疫ラベルします。そうでない場合は、48時間以内にイメージングを行ってください。1枚のスライドあたり最大6枚の切片をマウントし、共焦点イメージングのために切片の上にカバーガラスを載せます。光退色を防ぐため、スライドは暗所で保存してください。ライブイメージングを行う際、MGFPを注入した胚は遮光する必要があります。目的の発生段階に達する30分前に、ピンセットを使用して胚をコーティングしてください。コーティングした胚を0.01% Tricaを含む胚培地の鎮静液に移し、室温で15分間インキュベートします。35 mmガラスボトム培養皿に1%アガロース溶液を1滴分ずつピペットで滴下し、型を満たします。アガロースを凝固させます。ステレオ顕微鏡下で、90 mmのガラスキャピラリーチューブを用いて、arosの滴に3つの穴を開けます。ウェルの底を確認し、残留しているarosをピンセットで取り除きます。ステレオ顕微鏡下で、ディッシュに胚培養液を満たします。パスタピペットを使用して、胚をアロス（aros）の各ホールに1つずつ転移させます。微細鉗子を用いて、胚の関心領域（この場合は頭部背面）がガラス面に接するように向きを調整します。ディッシュに蓋をします。ディッシュを共焦点顕微鏡のステージまで慎重に運搬します。イメージングの間、胚を28.5 °Cに維持するためにスペースヒーターを使用してください。ここでは、4〜5体節期の野生型胚の後脳の断面を示しています。膜標的GFP（緑）とD（青）で二重標識されており、単一の細胞のみが膜結合GFPで標識されているため、細胞の形態と組織の高解像度イメージングが可能です。これは、4〜5体節期のnardi欠損変異体の後脳の比較画像です。この画像から、nardi変異体では、神経管閉鎖（neurorevelation）の間に細胞が正中線に対して適切に方向付けられないことがわかります。細胞をMGFPで標識する方法とは対照的に、β-カテニンなどの一般的な細胞表面マーカーを用いて後脳を標識しても、個々の細胞の形態を可視化することはできません。MG FPで標識した胚の後脳をタイムラプスイメージングで観察すると、ゼブラフィッシュの神経細胞の配置を駆動する細胞挙動は非常にダイナミックであり、細胞が移動し相互配置される際に膜突出の伸展が伴うことが明らかになります。以上で、高解像度でのシングルセルイメージングに向けて、固定および生きたゼブラフィッシュ胚の両方を準備する方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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