ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

本実験の全般的な目的は、ゼブラフィッシュ胚における神経細胞を高解像度でイメージングすることです。まず、膜標的型緑色蛍光タンパク質をコードするDNAをゼブラフィッシュの1細胞期胚に注入します。これによりモザイク状の継承が起こり、分散した細胞の高感度なイメージングが可能になります。次に、胚を抗GFP抗体で免疫染色し、切片を作成することで、固定標本における単一細胞の形態を高解像度で可視化します。あるいは、タイムラプスビデオ顕微鏡を用いて生存胚を観察し、細胞のダイナミクスをイメージングすることも可能です。

細胞の形態やダイナミクスを示す結果が得られます。ここでは、共焦点顕微鏡を用いてゼブラフィッシュの後脳をイメージングします。皆さん、こんにちは。

私は、メリーランド大学ボルチモア郡校生物科学科のRachel Brewster博士の研究室に所属しているPR Chandranです。本日は、ゼブラフィッシュ胚の神経細胞を高解像度でラベル化し、イメージングする手法をご紹介します。私たちは通常、この手法を研究室で用い、ゼブラフィッシュ胚における神経系の形成メカニズムを細胞レベルで研究しています。

それでは始めましょう。100 mmのペトリ皿の縁に、濡らしたキムワイプを配置します。

加湿したディッシュ内のワックスストリップに、ガラスマイクロインジェクション針を慎重に固定します。解剖用実体顕微鏡下で、針を目盛り付きのスライドガラスに合わせて調整します。適切なサイズの先端を得るために、清潔なカミソリの刃を使用して、針の直径が1 µmである箇所を軽く叩きます。

針をマイクロインジェクション装置に接続します。フェノールレッド水溶液を0.5 µL、パラフィルム上に滴下し、その液滴から針へフロントフィル（前方充填）を行います。マイクロインジェクションの圧力を7 kPaに設定し、まずは20 msのパルスで開始してください。すべての液体を分注するのに必要なパルス数をカウントします。分注に約250パルスかかるように、パルス時間を10 msから30 msの間で調整してください。

0.5 µLの溶液。マイクロピペットを用いて、可視化のためにフェノールレッドを混合した水溶性のMG FPD NAを0.5〜1 µL、針に逆充填します。実体顕微鏡下で、針内から溶液が蒸発するのを防ぐため、加湿ディッシュに蓋をします。

1細胞期の魚類胚を、胚培養液を満たした60 mmのペトリ皿に個別に配置します。細いピンセットを用いてコリアンをそっと掴み、胚を固定します。MGFPとフェノールレッドを満たした針を、注入対象部位まで移動させます。

広範囲にMGFPを発現させるには、卵黄または細胞質に注入します。マイクロインジェクション装置を用いて、約2 nanolitersのMGFP溶液を注入してください。フェノールレッド指示剤の位置を確認し、適切に注入されたことを確かめます。

胚から針を慎重に抜きます。ディッシュ内の胚を、一度に最大30個まですべて注入します。胚が光にさらされないように注意し、実体顕微鏡下で、胚が目的の段階まで発育するよう28.5 °Cでインキュベートします。

精細ピンセットを用いて、胚からコリオンをそっと剥がします。パスタピペットを使用して、空のコリオンをディッシュから取り除き、DECでコートした胚のみを残します。火で先端を処理したパスタピペットを使用して、注入済みのコート胚を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

余分な培地をできる限り取り除き、ativeを1 mL加えます。胚を室温の1X PBSで5分間ずつ3回洗浄します。実体顕微鏡下で、胚を1X PBSを満たしたシャーレに移動させます。

精密ピンセットを使用して、胚の尾部付近を保持します。2組目のピンセットまたはポーカーを用い、後方フレーム領域に触れないように注意しながら、可能な限り多くの卵黄を除去します。実体顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて胚をディッシュから持ち上げ、4%低融点アガロースを満たした切断用モールドに入れます。

胚をモールドの端に配置します。アロスを室温で凝固させます。スパチュラを使用して、硬化したアロスブロックをモールドから取り出し、カミソリの刃でブロックの底端を均等に切り落とします。

必要に応じて、瞬間接着剤を1滴使用し、ブロックの切断面を下にしてバイブレーターステージに固定します。ステージ上に複数のブロックを並べて配置します。ステージをバイブレーターに取り付けます。

ブレードが各胚を完全に切断し、かつブロックまで完全に切り抜けないようにしてください。ステージにXPBSを1セクション分満たします。胚をブロックの背面まで慎重に切り出し、XPBSを満たしたペトリ皿に移します。

実体顕微鏡下で切片を分離します。微小ピンセットを使用して、目的の切片を1x PBSを満たしたマルチウェルディッシュに移します。胚ごとに異なるウェルを使用してください。

切片をDPIで染色し、抗GFP抗体で免疫ラベルします。そうでない場合は、48時間以内にイメージングを行ってください。1枚のスライドあたり最大6枚の切片をマウントし、共焦点イメージングのために切片の上にカバーガラスを載せます。

光退色を防ぐため、スライドは暗所で保存してください。ライブイメージングを行う際、MGFPを注入した胚は遮光する必要があります。目的の発生段階に達する30分前に、ピンセットを使用して胚をコーティングしてください。

コーティングした胚を0.01% Tricaを含む胚培地の鎮静液に移し、室温で15分間インキュベートします。35 mmガラスボトム培養皿に1%アガロース溶液を1滴分ずつピペットで滴下し、型を満たします。アガロースを凝固させます。

ステレオ顕微鏡下で、90 mmのガラスキャピラリーチューブを用いて、arosの滴に3つの穴を開けます。ウェルの底を確認し、残留しているarosをピンセットで取り除きます。ステレオ顕微鏡下で、ディッシュに胚培養液を満たします。

パスタピペットを使用して、胚をアロス（aros）の各ホールに1つずつ転移させます。微細鉗子を用いて、胚の関心領域（この場合は頭部背面）がガラス面に接するように向きを調整します。ディッシュに蓋をします。

ディッシュを共焦点顕微鏡のステージまで慎重に運搬します。イメージングの間、胚を28.5 °Cに維持するためにスペースヒーターを使用してください。ここでは、4〜5体節期の野生型胚の後脳の断面を示しています。膜標的GFP（緑）とD（青）で二重標識されており、単一の細胞のみが膜結合GFPで標識されているため、細胞の形態と組織の高解像度イメージングが可能です。

これは、4〜5体節期のnardi欠損変異体の後脳の比較画像です。この画像から、nardi変異体では、神経管閉鎖（neurorevelation）の間に細胞が正中線に対して適切に方向付けられないことがわかります。細胞をMGFPで標識する方法とは対照的に、β-カテニンなどの一般的な細胞表面マーカーを用いて後脳を標識しても、個々の細胞の形態を可視化することはできません。

MG FPで標識した胚の後脳をタイムラプスイメージングで観察すると、ゼブラフィッシュの神経細胞の配置を駆動する細胞挙動は非常にダイナミックであり、細胞が移動し相互配置される際に膜突出の伸展が伴うことが明らかになります。以上で、高解像度でのシングルセルイメージングに向けて、固定および生きたゼブラフィッシュ胚の両方を準備する方法について解説しました。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。