Name: ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-05T17:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学ぶラットの中大脳動脈血管縫合閉塞法による局所脳虚血モデル構築技術。組織染色とMRIで梗塞部位を可視化し、脳卒中の病態理解と治療法開発に貢献する研究方法を習得できます。

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我々は、ベスラウフと磁気共鳴イメージングのためのウィスコンシン大学小動物のイメージング施設に感謝。ウィスコンシン大学マディソン校の神経外科では、この仕事のための資金を提供した。

MCAOラットモデル術前準備無菌操作は、すべての生存外科的処置に使用する必要があります。商業用消毒剤で外科作業面を消毒し、オートクレーブで滅菌手術器具のパック、ドレープ、ガーゼ、綿棒、縫合糸、およびメス刃を準備。手術用マスク、髪のボンネットと滅菌手袋を着用してください。 Germinator乾燥ビーズ滅菌器は、複数のラットの手術を1つのセッション中に行われる場合の手続きの間に手術器具をresterilizeするために使用されます。手術中のラットの低体温を防ぐために、吸収パッドの下に水ジャケット恒温毛布と場所をPrewarm。 <ol><li>誘導室に場所高血圧自然発症ラット（または任意の他のラット系統）とイソフルラン5％麻酔を誘発する（麻酔マシンは1.0 L / minに設定する必要がありますO 2と1.0 L / minのN 2 O）。麻酔を維持するためにイソフルラン1〜2％まで下げてください。 </li><li>両眼に人工涙液軟膏を適用します。 </li><li>バリカン（＃10ブレードとオスターA5）を使用して、将来の切開部位を超えて喉と左頸部の領域を剃る。 </li><li>ガーゼのパッドにBetadineを適用し、外側に螺旋状に、外科領域の中心から始まる皮膚を消毒する。同様のパターンでパッドを動かし、70％エタノールを含有する滅菌ガーゼパッドですすいでください。 3サイクルの合計のための両方のステップを繰り返します。 </li><li>将来の切開部位に沿って皮下0.5％ブピバカイン0.2mLを注入する。 </li><li>滅菌外科用ドレープと滅菌メリヤスやカバーにラットを置きます。 </li></ol> MCAの一時的な閉塞<ol start="7"><li>手術用顕微鏡下で、腹側正中切開を行い、浅筋膜を切除している。 </li><li> 、最後に胸鎖乳突筋と、顎二腹筋（簡単にその光沢のある白い腱の部分で識別される）、気管上正中線にある胸骨舌骨、：浅筋膜の下に、そこに三角形を形成し、左三筋に腺組織です。 </li><li>慎重に鋭いと鈍的切開は頚動脈（排他的鈍的切開が偶発的な組織の損傷を最小限に抑えるためにいくつかによって優先されることがあります）を識別するために、三角形の内部で実行されます。外部、内部、および総頸動脈（ECA、ICA、CCA）が公開されています。頸動脈は大きく、目に見えてパルスです。迷走神経は、両方に共通し、内頸動脈の外側面に沿って走ることと急激に一般的と内頸動脈から解剖されている見られている。 </li><li>二つのECAのブランチは、最初の分岐は、内側の見出しと第二の分岐が横方向に向かって、急激に解剖されています。両方のブランチには、大きな船を動員でより容易にするために可能になる、焼灼とカットされています。 </li><li> ECAは、今より吻方解剖される。舌骨が発生する可能性があります、これは吻側節の切除範囲が制限されます。外頸動脈は6から0絹縫合糸で遠位方向に可能な限りオフ結びついています。 </li><li>別の6から0絹縫合糸は、ICAとの分岐の近くにECAの周囲に疎に配置されます。閉塞のために使用する管腔内縫合後の手順で、ここを通過するように血管を閉塞しないようにしてください。 </li><li>顕微クリップは、分岐の近くに、共通および内部頸動脈上に配置されています。 </li><li>最初の部分的な動脈切開は、外頸動脈に2つの絹縫合糸の関係の間に作成されます。 </li><li>顕微クリップが配置されているCCAに向かってECA内腔に、その丸みを帯びた、シリコンでコーティングされた先端からキンク2.0 Cmを、4から0モノフィラメントナイロン縫合糸2.2 -3.0 cmの長さをご紹介。これらの縫合糸は、（Doccol社、レッドランズ、カリフォルニア州、米国）市販されている。切り株と位置ECAとICAの分岐下切り株を解放するECA（部分的な動脈切開部位で）の残りの部分を切り取り、これをより簡単腔内縫合糸は、ICAにスライドできるようになります。 </li><li>腔内ナイロン縫合糸を固定し、出血を予防し、ICAからの微小血管クリップを削除するには、ECAの切り株の周りに絹の縫合糸を締めます。出血を確認するためにそれを削除する前に、ゆっくりとクリップを開きます。 </li><li>中大脳動脈（MCA）にECAからICA内腔にナイロン縫合糸を進め続ける。この長さは通常、18〜20ミリメートルで、挿入する前に、縫合糸のよじれを配置するための理由です。ナイロン縫合糸の可変長が挿入された後、抵抗を感じることがあります。これは多くの容器の外にまだ存在ナイロン縫合糸のでが発生した場合、それは、縫合糸は、おそらく（下記の注を参照）翼口蓋動脈に入っていることを示しています。と引いて、曲線縫合糸が少し内側に実行される、ICAに沿って継続する。また、PPAの起源の解剖は、より適切なパスを可視化するために行われることがあります腔内フィラメントの。抵抗が2センチメートルキンク位置し、後に感じられるまでナイロン縫合糸を挿入し続ける。この時点で、腔内縫合糸は、MCAの起源をブロックしています。 MCA閉塞は、レーザードップラー流量計を（一つの機器のソースの材料表を参照）を使用して局所脳血流量の減少を監視することにより確認することができます。また管腔内縫合糸でこの容器の偶発的な挿管を避けるために、好ましい場合ICAの翼口蓋動脈からの起源が直接、オフ結合できることに注意してください。 </li><li>タイマーと記録閉塞の開始時間を開始します。 </li><li> CCAからマイクロクリップを取り外します。 </li><li> 3から0絹縫合糸（単純な連続パターンの再灌流のために再オープンするが促進される）とすぐに切開を（真皮、組織層carnosus、皮下組織の層）閉じて、慎重に回復ケージにラットを置きます。鼻と口の周りケージの床は、敷料と麻酔からのモニターの回復がないことを確認してください。 </li></ol> MCAの血流の回復（再潅流） <ol start="21"><li>閉塞期間が終了する直前に、ラットを再び麻酔Betadineと70％エタノール（3サイクル、前と同じように）に切開部位を消毒し、閉鎖縫合糸を除去して切開を再度開きます。 </li><li>以前と同様に、CCA上でマイクロクリップを置きます。 </li><li>縫合糸の端は、ICAを通して見えるようになるまでICAから遮蔽縫合の途中で撤退。 十分にICA / ECAから縫合糸を除去しないでください！ </li><li>腔内縫合糸の端の上にICAでマイクロクリップを置きます。 </li><li>完全に遮蔽縫合糸を除去し、しっかりとECAの切り株をオフにネクタイ。閉塞の記録の終了（再灌流の開始）時間。 </li><li> ICAからマイクロクリップを取り外します。 </li><li> CCAからマイクロクリップを取り外します。 </li><li>滅菌生理食塩水を数滴で地域を湿らせ、簡単な中断パターンを使用して3から0絹縫合糸で切開層（真皮、組織層carnosus、皮下組織）を閉じます。 </li><li>腹膜腔に（あなたの機関のガイドラインに従って、または他の適切な術後の鎮痛剤）0.05 mg / kgのブプレノルフィンを投与する。 </li><li>温めた生理食塩水腹腔内の5ccを注入する。これは、回復期の間に水和を提供します。 </li><li>麻酔からのラットの回復を監視します。 </li><li>ラットが回復した後は、尾でラットを保持し、ラットの両側に回すことができるかどうかを観察することにより、心筋梗塞の行動を示すかどうかをテスト。片側にカールするだけ期待されている。単純なスコアリングスケールは、（説明を参照）初期のポスト梗塞behavorial機能を記録するために使用することができます。 </li><li>ブプレノルフィン（上記と同じ用量）の追加の注射は痛みの軽減の24時間ごとに6〜8時間を与えられるべきである。動物は、不快感の兆しを見せている場合鎮痛を拡張。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。血管縫合糸による中大脳動脈の閉塞。ラットの頭蓋循環系の概略図は、MCAの起源を閉塞シリコンコーティングされた管腔内縫合糸で示されています。左のECAのオフOAとSTの枝を結紮し、ECA遊説して回る縫合のネクタイは、場所の管腔内縫合糸を保持している。 ACA、前大脳動脈、BA、脳底動脈、CCA、総頸動脈、ECA、外頸動脈、ICA、内頸動脈、MCA、中大脳動脈、OA、後頭動脈、PCA、後大脳動脈、PComA、後交通動脈、PPA、翼口蓋動脈、ST、上甲状腺動脈。図は、佐々木ら 4と ​​リー3から適応。 <img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。ラット脳24時間の冠状セクションの代表的な磁気共鳴イメージングは、1時間の過渡MCAO後。局所的虚血に伴う脳浮腫はT2強調MRI画像で可視化される。梗塞ゾーンは、T2画像で（明るい）高信号が表示されます。同様の梗塞のパターンは、拡散強調画像と見かけの拡散係数のマッピング5など、より高度なMRI技術を見ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1978/1978fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。ラットの脳の代表的な冠状のセクションでは、1時間の過渡MCAO後のTTC 24時間で染色。TTC染色は図2に示したものと同じラットの大脳皮質と線条体の白色（未染色）梗塞領域を明らかにする。組織学的に決まる、最終的な梗塞領域は、T2病変よりわずかに小さいかもしれないが、焦点虚血性病変の一般的なパターンは、MRI T2強調画像に見られるものと同様であることに注意してください。

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</ol>

著者らは、開示することは相反する利害関係はありません。 このプロトコルは、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所で医学と公衆衛生及び遵守のウィスコンシン大学マディソン校の学校で動物実験用の委員会により承認された。

脳虚血の齧歯類のモデルは、グローバルまたは焦点となどの可逆または不可逆的に分類することができます。私たちは、人間の脳卒中患者では、次の再疎通を発生する可能性が再灌流障害を模倣するために、可逆局所的虚血モデルを使用します。ラットの株式人間、ウィリスのサークルによる広範な頭蓋内側副血行路と一貫性のない梗塞ボリューム6の軟膜吻合の結果と同様に頭蓋循環の利点ながら。梗塞サイズ7-10正常血圧ラットと比較して局所脳虚血にさらさSHRsに大きいので、我々は、高血圧自然発症ラット（SHR）株を使用してください。 SHRsのストローク誘導はまた、より一貫性があり、他の一般的に使用される菌株11のよりも死亡率が生成されることがあります。変動が梗塞体積の変動に追加できるので、さらに、生理的パラメータは、手術中に監視する必要があります。これらのパラメータは、血圧、動脈のO 2及び虚血性傷害2,12を悪化させるCO 2レベルは、低体温、および高血糖を、含まれています。それは神経虚血性損傷の程度を軽減する、そのため、手術中の体温調節加熱パッド上にラットを置くことが不可欠であることができるので、低体温症は、特に懸念される。 我々は、商業的に調製シリコンでコーティングされた梗塞サイズ13-15一貫性を高めるための試みで、この手順で縫合糸を採用。伝統的に、MCAを閉塞するために使用する管腔内縫合糸は、火炎、丸め3から0ナイロン縫合糸の先端またはコートの小さな接着剤ビーズ16の縫合糸の先端をするためにホットグルーガンを使用することによって調製されている。これらの手順は、さまざまな先端径を持つ縫合糸を生産し、したがって、与えられたラットの血管の直径と一致する縫合糸を見つける前に閉塞におけるいくつかの試みが必要になる場合があります。このビデオで説明されているMCAO方法に関するその他のバリエーションは、担保の血流6,9を減らすために純粋な皮質梗塞17、およびMCAと同側の総頸動脈の同時閉塞を持っているために、レンズ核線条体枝を温存し、より遠位の閉塞を、含まれています。 脳卒中の機能的効果は、特定のタスクの赤字は、単純なスコアリングの規模に反映されている行動テスト、さまざまなを用いて評価することができる。例えば、Bederson ら 18は、上昇体の位置、横方向のプッシュに非対称性、およびオープンフィールド旋回動作で前肢屈曲の程度に神経学的スコアのグレーディングラットを開発した。ラット上昇床に、両方の前肢を拡張し、対側前肢の屈曲を持つラットのみ&quot;中程度の赤字（1）&quot;と分類されたのに対し、他の赤字は、&quot;（0）ノーマル&quot;等級付けされなかった展示。 &quot;重度の等級2&quot;のラットは、横力に対側で減少した抵抗を表示し、&quot;厳しい等級3&quot;ラットは、さらに行動を一周に従事。低学年の行動障害は、常に次の上位グレードで観察（例えば、グレード2と3匹の動物にも前肢屈曲を表示）と、これらのスコアは、梗塞サイズ18の差の予測であった。従って、このような単純なスコアリングシステムは、脳卒中からの機能障害の迅速な、一貫性の半定量的評価が可能になります。 脳梗塞の程度の測定は、一般的TTC、クレシルバイオレット（ニッスル染色）またはヘマトキシリン​​とエオシンを用いて組織の損傷の組織学的染色によって達成されます。拡散強調閉塞後早期の時点で梗塞を視覚化するためにMRIを含む磁気共鳴イメージング技術は、組織を採取することなく、個々のラットにおける梗塞体積の測定を可能にする。イメージングMCAO後のラットが治療前の政権にすべての実験および対照動物は、ばらつきの交絡影響を軽減する、開始するために同じようなストロークを経験した研究者の自信を与え、これが脳卒中後の神経保護治療の有効性を決定することを目的とした研究では特に貴重です。ストローク誘導インチ

<table><tbody><tr><td>4-0 ナイロン縫合糸</td><td>Doccol Corporation</td><td></td><td>シリコンコーティング長 2-3 mm、先端径 0.39 mm</td></tr><tr><td>自然発症高血圧ラット</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>290-300 g、雄</td></tr><tr><td>Gaymar T/Pump 体温調節ポンプおよびパッド</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetroson V-10 バイポーラ電気手術装置</td><td>Summit Hill Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 ガラスビーズ滅菌器</td><td>CellPoint Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vasamedics Bpm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;Laserflo 血流モニター</td><td>TSI Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

脳卒中は、身体障害、1世界中の成人の死因の第3位の主要な原因です。人間のストロークでは、非常に可変臨床状態が存在し、局所的虚血の動物モデルの開発では、しかしながら、実験的に誘発梗塞体積の再現性を達成することが不可欠です。ラットは、その比較的低い畜産コストへと人間2,3のように、その頭蓋循環の類似性に起因する脳卒中のための広く使用されている動物モデルである。ヒトでは、中大脳動脈（MCA）は、最も一般的に脳​​卒中症候群に影響されており、MCA閉塞（MCAO）の複数のメソッドは、動物モデルにおけるこの臨床的な症候群を模倣するために記載されている。再疎通が一般的に人間の急性脳卒中後に発生するため、閉塞の期間後の再灌流は、これらのモデルの多くに含まれています。このビデオでは、我々は、高血圧自然発症ラット（SHR）における一時的な血管縫合MCAOモデルを示しています。シリコンチップのコーティングされたフィラメントは、再灌流に続いて、60分間MCAの原点にintraluminally配置されます。最適な閉塞期間がそのようなウィスターまたはSprague - Dawley系など、他のラット系統、に大きく左右されますのでご注意ください。ラットにおける脳卒中のいくつかの行動の指標が示されている。局所的虚血は、2,3,5 - トリフェニル塩化（TTC）MCAOから24時間後に脳切片を染色することによってT2強調磁気共鳴画像を用いて確認されています。

ラットにおける虚血性脳損傷の外科的誘導は、脳卒中の研究に広く使用されているモデルです。ここでは、中大脳動脈の閉塞による局所脳虚血の誘導を示す。組織染色および磁気共鳴イメージングによる結果梗塞の可視化も示されている。

脳卒中は、世界中の成人の心身機能障害の主要な原因であり、死因の第3位となっています1。ヒトの脳卒中においては、非常に変動性の高い...

このビデオでは、ラットの中大脳動脈を血管内塞栓することで脳梗塞を誘発する方法を実演します。これは脳卒中研究で広く用いられている動物モデルであり、大脳皮質だけでなく、基底核や視床下部を含む皮質下構造にも虚血を引き起こします。このモデルを用いて、永久的または一過性の脳虚血のいずれかを誘発することが可能です。管腔内縫合糸をそのままにするか、あるいは一定期間後に除去するかによって異なります。脳虚血は、細胞死が起こる梗塞コアと、一部の細胞回復が期待できるペナンブラと呼ばれる虚血周辺領域を形成します。開始する前に、これから行う手順について説明します。ここでは、ラットの頭部血行系の簡略化した図を示します。本手術では、総頸動脈（CCA）が外頸動脈（ECA）と内頸動脈（ICA）に分かれる分岐点付近で、左頸動脈を露出させます。ECAの2本の小さな分枝である後頭動脈と上甲状腺動脈をバイポーラ凝固法で結紮し、ECAをこれら2本の分枝より遠位側で結紮します。絹縫合糸を用いて、総頸動脈および内頸動脈にマイクロ血管クリップを装着します。次に、シリコンコーティングされた先端を持つナイロンモノフィラメント縫合糸を外頸動脈（ECA）の切開口から挿入し、内頸動脈（ICA）へと通します。この管腔内縫合糸を、ICAからマイクロクリップを外す前に、シルク縫合糸を用いてECAの周囲で軽く結んで固定します。その後、管腔内のナイロン縫合糸を約2cm進め、シリコンチップで中大脳動脈（MCA）の起始部を閉塞させます。2つ目のマイクロクリップをCCAから取り外し、遮断時間を計測します。これで手順の概要が把握できたので、手術に移ります。所属機関の動物愛護ガイドラインに従い、通常の手術手順と同様にラットを準備します。導入には5%のイソフルランを用い、酸素 1 L/min および亜酸化窒素 1 L/min の流量で麻酔をかけ、維持にはイソフルラン濃度を1〜2%に下げます。麻酔深度が十分に達した後、両眼に人工涙液軟膏を塗布し、クリッパーで頸部を剃毛します。その後、ベタジングル溶液で患部を消毒し、続いて70% ethanolで洗浄します。このベタジンと70% ethanolによる洗浄工程を計3回繰り返してください。個体を滅菌済みのストッキングに入れ、温度調節用ブランケットの上に寝かせます。これは低体温症を防ぐためです。15 mLコニカルチューブを頭の下に滑り込ませて首をわずかに高くすると有用です。これにより、後の総頸動脈の露出が容易になります。最後に、術後の疼痛緩和を目的として、手術用顕微鏡下で、予定切開部位に沿って0.5%局所麻酔薬溶液0.2 mLを皮下注射します。10番のメス刃を用いて正中切開を行います。残りの解剖は、動物の中線より左側で行います。まず、浅筋膜を切開し始めます。これは、鈍的解剖と鋭的解剖を組み合わせて行います。側方に広範な腺組織が見られ、正中線上には大きな胸骨舌骨筋が位置しています。綿棒を使用して、腺組織を側方へ、胸骨舌骨筋を内側へ展開し、気管を露出させます。腺組織の下には、顎二腹筋と胸骨乳様突起筋が見えます。これらは正中線の胸骨舌骨筋とともに、頂点が丸で囲まれた小さな三角形を形成しています。この三角形の範囲内で、頸動脈に向かって解剖を続けます。マイクロ剪刀を用いて、筋肉を覆っている筋膜を切開します。これにより筋肉を牽引することができ、下層の血管を露出させることが可能になります。綿棒を使用して筋肉を牽引し、総外頚動脈、外頚動脈、および内頚動脈を露出させます。さらに操作を続け、外頚動脈とその分枝を露出させます。この際、血管の慎重な鋭的剥離が必要となります。これらの手順の目的は、外頸動脈（ECA）および内頸動脈（ICA）を下方にある結合組織から遊離させることです。引き続きECAを解剖します。この際、舌骨（hyoid bone）に突き当たることがあり、それによって吻側への解剖範囲が制限されることに注意してください。白色に見える迷走神経が、総頸動脈と内頸動脈の両方の外側を走行しているのが確認されるため、総頸動脈（CCA）および内頸動脈（ICA）を鋭的に剥離します。外頸動脈（ECA）から分枝する2本の血管も同様に鋭的に剥離します。外側に向かう最初の分枝が後頭動脈であり、内側に向かう2番目の分枝が上甲状腺動脈です。ECAから分枝する第1および第2の分枝を焼灼し、続いて切断します。これらの分枝を切断することで、血管の剥離・移行がより容易になります。その後、処置の後半で、シルク縫合糸を用いてECAを可能な限り遠位側でしっかりと結紮します。総頸動脈の分枝点より近位側の外頸動脈（ECA）に、別の絹糸を緩く結びつけます。中大脳動脈閉塞に使用する血管内縫合糸のように、この結紮で血管を閉塞させないように注意してください。このECAの部分を通過して、総頸動脈と内頸動脈の両方にマイクロ血管クリップを装着します。その位置は、外頸動脈（ECA）の起始点からわずかに離れています。次に、ECAの2本のシルク結紮糸の間で部分的な動脈切開を行います。少量の残留血液が流出することがありますが、大量に出血する場合は、マイクロバスクラークリップによるクランプが不適切である可能性があります。この場合、クリップのブレードに下層組織が挟まり、完全に閉じなくなることがないか確認してください。次のステップは、3 cmのモノフィラメントナイロン縫合糸を外頸動脈（ECA）に挿入することです。シリコンコーティングされた先端から2 cmの地点に縫合糸に印を付けておくと便利です。これらの縫合糸は市販されており、使用するラットの年齢や体重に応じて、先端径やシリコンコーティングの長さを仕様に合わせてカスタム設計することが可能です。300 gのラットの場合、4-0ナイロン縫合糸を使用し、先端径0.39 mm、シリコンコーティング長2〜3 mmのものを使用します。閉塞用のナイロン縫合糸を外頸動脈（ECA）の内腔から総頸動脈に向かって挿入します。ECA断端の周囲をシルク縫合糸で締め、管腔内のナイロン縫合糸を固定して出血を防ぎます。ECAの残りの部分を切断して断端を遊離させ、管腔内縫合糸が内頚動脈（ICA）に滑り込みやすくなるよう、ECA断端を分岐点の下方に配置し、おおよそICAと直線状になるようにします。ICAから微小血管クリップを取り外します。完全に除去する前に、クリップをゆっくりと開き、出血がないか確認することを忘れないでください。ナイロン縫合糸をICA腔内で、中大脳動脈に到達するまで進め続けます。この長さは通常2 cm程度であり、挿入前に縫合糸に印を付ける理由となっています。任意の長さのナイロン縫合糸を挿入した後、抵抗を感じることがあります。ナイロン縫合糸の大部分がまだ血管の外にある状態で抵抗が生じた場合、それは縫合糸が口蓋動脈に入っている可能性が高いことを示しています。この場合は、一度引き戻し、縫合糸をわずかに湾曲させて、より直接的に走行しているICAに沿って進めてください。これら2つの比較ショットにおいて、ICA腔内の縫合糸の位置が変化していることに注目してください。挿入した縫合糸の大部分が通り、再びこの地点で抵抗が感じられるまで、ICAを通して縫合糸を進めます。腔内縫合糸によってMCAの起始部が閉塞されました。タイマーを開始し、遮断時間を記録します。開始時間を記録してください。CCAからもう一方の微小血管クリップを取り外し、切開部を迅速かつ慎重に閉鎖します。ラットをリカバリーケージに入れる。閉塞期間が終了する直前に、鼻と口の周囲のケージ底面に床材が付着していないことを確認する。ラットを麻酔し、結紮糸を除去して切開部を再び開く。前述と同様に、CCAにマイクロクリップを装着する。塞栓用の縫合糸を、糸端がICAから見える位置まで、ICAから部分的に引き出します。この時点では、まだ縫合糸を完全に除去しないでください。次に、管腔内にある縫合糸の位置よりも上方のICAに別のマイクロクリップを装着し、塞栓用の縫合糸を完全に除去して、ECAの断端を結紮します。再灌流開始時刻を記録します。ICAおよびCCAからマイクロクリップを取り除き、その領域を数滴の滅菌生理食塩水で湿らせてから、切開部を縫合して閉じます。術後の追加鎮痛のため、ブプレノルフィンを体重1kgあたり0.05mgの用量で投与します。また、回復期の水分補給のため、生理食塩水5 mLを腹腔内投与します。ラットが麻酔から回復した後、ラットの尾を持って持ち上げ、体が両側に回転できるかを確認する挙上身体スイング試験を行い、梗塞による行動学的指標をテストします。期待される結果として、梗塞が起きた個体は片側だけに丸まります。脳卒中の症状を示すラットは、オープンフィールドでの移動中に片方向への旋回行動を示す場合もあります。ここでは、自然発症高血圧ラットにおける60分間のMCA閉塞の結果を示します。MCAOの24時間後に磁気共鳴画像法を行い、2種類の強調画像を示しています。このラットでは、皮質領域と線条体領域の両方を含む広範な梗塞が発生しました。MRIにおける高信号域は黄色で強調されていますが、ここではその結果は示していません。MRIで可視化された梗塞領域は、拡散強調画像および見かけの拡散係数（ADC）マップを用いてさらに解析することが可能です。梗塞領域は、新鮮に摘出した脳切片を2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）で組織染色することによっても確認されます。生存組織中のTTC脱水素酵素が基質を不溶性の赤色染料に変換します。したがって、梗塞領域は染まらずに白く見えます。梗塞サイズは、ラットの系統や動物の大きさを含むいくつかの要因によって影響を受けることに注意してください。我々は、frogg、dolly、またはwistarなどの一般的に使用される他の系統よりも、梗塞サイズがより一貫して得られるため、自然発症高血圧ラットを使用しています。また、血管径のばらつきを抑え、その結果としてMCAA閉塞の有効性を安定させるためには、標的となるラットの体重を標準化することが重要です。このビデオが、皆様の研究室でのMCA閉塞法の実施に役立つことを願っております。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶラットの中大脳動脈血管縫合閉塞法による局所脳虚血モデル構築技術。組織染色とMRIで梗塞部位を可視化し、脳卒中の病態理解と治療法開発に貢献する研究方法を習得できます。

ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル

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