Name: の準備ショウジョウバエ S2細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶショウジョウバエS2細胞の光学顕微鏡用前処理法。レクチンコーティングによる細胞接着と扁平化、固定・免疫染色の手順を解説。遺伝子機能解析や細胞構造の可視化に有用な実験プロトコルです。

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この作品は、国立がん研究所P30 CA23074、米国癌学会機関研究助成74-001-31、および大学によって部分的にサポートされていました。アリゾナGI SPORE（NCI / NIH CA9506O）の。

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞生物学の分野では、理想的なシステムは、維持するために安価な操作が容易、とのさまざまな技術に従順であろう。 ショウジョウバエ S2細胞がこれらの要件を満たすので、それらは急速に細胞の増加のために最適なシステムとなっている生物学研究所。 我々は、顕微鏡観察のためにS2細胞を準備する方法の概要を提示している。 S2細胞の顕著な美徳は、通常の大気中、室温でよく育つという事実であるため、彼らは特別なメンテナンスの必要なく、延長後の期間の顕微鏡に残さできます。それらは一般的にやや丸みを帯びた、通常の培養条件の下で緩く付着しているにもかかわらず、S2細胞が広範囲にイメージングのために平らに誘導することができる。コンカナバリンでプレコーティングしたガラスボトムディッシュ上で培養したS2細胞は、それらの優れた顕微鏡の標本作り、カバーガラス上に添付し、薄く広がっていく。

<table><tbody><tr><td>S2細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2細胞</td><td>DGRC</td><td>ストック番号 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2細胞</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>10%（最終濃度）の熱不活化FBSを添加して完全培地とする。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>100倍抗生物質溶液</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>ペニシリン (10000 U/mL)、&lt;br/&gt;ストレプトマイシン (10000 &amp;#x03BC;g/mL)、および&lt;br/&gt;アムホテリシンB (25 &amp;#x03BC;g/mL) を含有</td></tr><tr><td>コンカナバリンA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% 溶液</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>脱水、ACSグレード</td></tr><tr><td>モレキュラーシーブ</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>タイプ 3A</td></tr></tbody></table>

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> s2細胞

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

理想的な実験系では、さまざまな技法に従順維持するために、安価で簡単になる、と広範な文献とゲノム配列のデータベースでサポートされる。培養ショウジョウバエ S2細胞を、引き離さ20〜24時間齢の胚1の製品は、すべてのこれらの特性を有する。そのため、S2細胞は非常に分子プロセスのコンポーネントまたは関心のメカニズムをコードする遺伝子の発見を含む細胞プロセスの分析に適しています。それらのユーティリティのほとんどの責任があるS2細胞の特徴は、二本鎖（ds）RNAを介した干渉（RNAi）、および蛍光顕微鏡への従順さ、ライブまたは固定のどちらかのように彼らの絶妙な感度、それらが維持されると使いやすさです細胞。 S2細胞は、安価な、市販の、完全に定義されて、無血清培地2の数を含め、様々なメディアに成長させることができる。さらに、彼らは21〜24℃で最適にかつ迅速に成長し、コンテナの様々な培養することができる。哺乳動物細胞とは異なり、S2細胞は安定化の雰囲気を必要としませんが、代わりに通常の空気とよく行い、さらに密閉フラスコに維持することができる。 S2細胞にRNAi実験のしやすさを補完するのが容易に相または固定またはライブの細胞の蛍光顕微鏡で実験的に誘発された表現型を解析する機能です。 S2細胞は、単一の単層として培養中で成長が接触阻害を表示しません。その代わりに、細胞が密集培養物中のコロニーに成長する傾向がある。低密度で、S2の文化は、ラウンドと、ゆるやかに接続されているガラスまたは組織培養用プラスチック上に成長。しかし、S2細胞の細胞診は非常にレクチン、コンカナバリンA（ConA）3を塗布した面に一時的に培養することにより、広くフラット化して、それらを誘導することによって改善することができます。 S2細胞はまた、安定してライブまたは固定化細胞への関心のラベルの構造や細胞小器官への蛍光タグ付きマーカーをトランスフェクトすることができます。したがって、細胞の顕微鏡分析のための通常のシナリオはこうです：まず、S2細胞は（タグ付きマーカーを発現する導入遺伝子を保有することができます）標的タンパク質（s）を除去するためにRNAiにより扱われます。 RNAi処理時間は、蛋白質の違いは、速度オーバーターンと標的蛋白質が存続にとって重要である場合、セルの外傷/死を最小限に抑えるためにできるように調整することができます。次に、処理した細胞を分散させる細胞を誘導し、しっかりとガラスに付着する錯那でプレコーティングカバースリップを含む皿に移しています。最後に、細胞を顕微鏡モードの研究者の選択方式で撮像する。これらの細胞は通常の室温、大気中で健康を維持するので、S2細胞は生細胞の拡張された可視化を必要とする研究に特に適しています。

ショウジョウバエシュナイダー（S2）細胞は、遺伝子の発見と機能解析のためのますます普及システムです。私たちの目標は、このような重要性を増し、実験システムS2細胞を作る顕微鏡技術のいくつかを説明することです。

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> S2細胞

理想的な実験系とは、安価で維持が容易であり、さまざまな手法を適用でき、かつ膨大な文献による裏付けがあるものである。

本手順の全体的な目的は、光学顕微鏡観察に向けたDrosophila S2細胞の調製方法について説明することです。まず、ガラスボトム培養ディッシュを調製します。次に、そのガラスボトムをレクチンConvalでコーティングします。S2細胞の接着と平坦化を促進します。手順の3番目のステップは、培養液とS2細胞を培養皿に添加することです。手順の最終ステップは、培養皿内のS2細胞を固定し、免疫染色することです。最終的に、生細胞または固定されたS2細胞の蛍光顕微鏡観察を通じて、それぞれfluoro fourでタグ付けされた、あるいは免疫標識された目的タンパク質の局在を示す結果を得ることができます。アリゾナ大学細胞生物学・解剖学部門のGreg Rogers研究室のJoey Clubです。同じくRogers研究室のJohn Nyeです。そして、私はダン・バスターです。グレッグ・ロジャースの研究室に所属しています。本日は、光学顕微鏡観察に向けてDrosophila S2細胞を準備する手順をご紹介します。当研究室では、重要な調節タンパク質の除去または過剰発現後の中心粒数と構造の変化を調べることで、Drosophilaにおける中心体重複の調節を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。ガラス底ディッシュの作成には、標準的な35 mmペトリ皿を使用します。これらのガラスボトムディッシュは、細胞を通常の培養条件に非常に近い状態で保持できるだけでなく、顕微鏡グレードのガラスを通して生細胞を観察することを可能にします。ガラスボトムディッシュを組み立てる際は、厚壁の発泡スチロール箱にテープを貼った表面を穴あけ面として使用します。35 mmペトリ皿の下半分を、皿の底面が発泡スチロール箱に接するように穴あけ面上に置き、皿の両端をしっかりと固定しながら、3/4インチのスペードビットを装着したハンドドリルを使用して、皿に穴を開けます。すべてのディッシュへの穴あけが完了した後、粗目の粒度で直径がスパードリルと同程度の円錐形グラインディングビットを使用して、穴の外側の縁を滑らかにします。電動ドリルの本体を横にし、ビットがカウンターの端から突き出すように配置します。10 kgの砂を入れた丈夫なプラスチック袋など、重量がありつつ柔軟なものをドリル上に置いて固定してください。ドリルを連続して動作させるには、ロックオンボタンを使用してください。ディッシュを保持しながら研削ビットに押し当てて動かし、新しく開けた穴の粗い縁を滑らかに整えます。穴の外縁が滑らかになった後、ディッシュの底部を大きなビーカーに入れ、蒸留水で数回すすいでください。これにより、後で浮上してくるプラスチックやスチロフォームの小さな破片を取り除くことができます。ディッシュの底を並べて乾燥させます。ディッシュが乾いたら、Sard 180 4 接着剤を準備します。樹脂と硬化剤を重量比10:1で混合し、十分に攪拌します。各ディッシュの外表面にある穿孔の周囲に、接着剤を小さな円状に塗布します。次に、接着剤に接するように、穴の上にカバーガラスを配置します。カバーガラスは、ペトリ皿にある穴よりも少なくとも約1 mm大きく、かつ皿の直径よりも小さいものである必要があります。カバーガラスが皿にスムーズかつ均一に密着していることを確認してください。ここで、皿を脇に置いておきます。底面を上にして乾燥させます。室温では1日以上かかる場合がありますが、ディッシュを温暖なインキュベーターに入れることで硬化速度を上げることができます。ディッシュが乾燥したら、レクチンConcanavalin A（Con A）でコーティングします。Con Aでコーティングしたカバーガラス上に配置されたS2細胞は広範囲に伸展するため、顕微鏡観察に最適な試料となることから、ここではCon Aを使用しています。ガラス底皿をコーティングするには、10 µLのコーティング溶液をガラスの上面に広げます。乾燥後、皿とそのカバーをUVライトで滅菌します。組織培養用クリーンベンチ内で、内面がUVランプに直接向くように配置し、滅菌用UVライトを少なくとも45分間点灯させます。S two細胞は、さまざまな培地で培養可能です。本研究では、in VITROGEN SF 902培地を使用します。顕微鏡観察用にRNAi処理したS two細胞を準備するには、細胞を緩やかに再懸濁し、2 mLの培地を含むconneコート済みガラス底ディッシュに移します。健康な細胞がconneコートされたカバーグラスに接触すると、強固に接着し、広がり始めます。このプロセスは約15分で顕著になり、45分から1時間で完了するはずです。S two細胞は通常の室温および大気条件下で容易に維持できるため、顕微鏡観察中に細胞の脱水を防ぐための特別な条件や装置は必要ありませんが、ディッシュ内に十分な培地を保持してください。S two細胞の長期間にわたるライブイメージングが可能です。これらの実験の実行時間は、一般的な問題である光退色と光毒性によってのみ制限されます。S two細胞は、ガラスボトムディッシュまたは通常のカバーガラスのいずれかに固定することが可能です。しかし、本ビデオでは、ガラスボトムディッシュを用いた固定および免疫染色の手順を実演します。メタノールとホルムアルデヒドは、S2細胞で一般的に使用される2種類の固定液です。メタノールで細胞固定を行うには、まず1Lの蓋付きガラスビーカーに約300 mLの無水メタノールを入れ、防爆仕様の-20 °Cフリーザーで冷却します。メタノールが十分に冷えたらフリーザーから取り出します。ガラスボトムディッシュから培地を速やかに除去し、直ちにディッシュをメタノールの中に浸します。ディッシュを入れたビーカーを速やかにフリーザーに戻し、細胞を10〜15分間固定します。10〜15分後、ビーカーからディッシュを取り出し、残っているメタノールを捨てて細胞を再水和させます。PBSTを加えることで、細胞は標準的な染色手順に進む準備が整います。この手順については、後述の細胞固定のセクションで説明します。ホルムアルデヒドには、10%ホルムアルデヒドと緩衝液を使用します。この比較的高濃度のホルムアルデヒドを使用するのは、S two細胞には細胞質の中間径フィラメントが欠如しており、固定プロセス中の細胞形態と組織の維持を助ける構造がないためです。細胞を10%ホルムアルデヒドで10〜15分間固定します。固定が完了したら、ホルムアルデヒドを廃液ビーカーに捨て、固定した細胞をPBSTで3回短く洗浄します。固定細胞にブロッキング液1 mLを加え、15分間静置して免疫染色の手順を開始します。通常、PBSTで希釈した5%正常ヤギ血清を使用します。ブロッキング液を捨て、一次抗体を細胞に直接加えます。抗体溶液の蒸発を防ぐためにペトリ皿の蓋を戻し、室温で30分間、抗体を細胞とインキュベートさせます。30分後、一次抗体溶液を除去します。トランスファーピペットを使用して、ディッシュにPBSTを2 mL加え、5分間待機してからPBSTを回収します。その後、PBSTで3回洗浄します。最後の洗浄後、二次抗体100 µLを細胞に直接滴下します。ペトリ皿に蓋を戻し、抗体を細胞と共に30分間インキュベートします。室温で行ってください。30分後、二次抗体を除去し、PBSTで5分間の洗浄を3回行います。最後に、封入剤を数滴、細胞の上に直接加えます。ペトリ皿の蓋を閉め、必要に応じて、皿を4 °Cの暗所に保存します。ここでは、コンフルエントおよびコーティング済みのガラスボトムディッシュに播種した後のS2細胞の代表的な位相差顕微鏡像を示しており、数値は播種後の経過時間を分で表しています。自己平坦化は15分までに現れ、60分までにはほぼ完了します。コーティングされたカバーガラス上で細胞が平坦化するにつれて、位相差で暗くなることに注目してください。接着した細胞の拡大画像では、矢印で示された伸展し平坦化した辺縁がはっきりと確認できます。S two細胞をトランスフェクションし、固定細胞または生細胞内の目的の構造を標識する蛍光タグ付きタンパク質を発現させることができます。この例では、核のマーカーであるnucleo foinと蛍光タンパク質fluoro four EGFPを融合させた融合コンストラクトを、S two細胞に一過性トランスフェクションしました。これらの細胞をconnaコーティングしたガラスボトムディッシュに播種し、DICおよびエピ蛍光顕微鏡で観察しました。RNAi処理したS2細胞は、固定して免疫蛍光染色により解析することも可能です。これらの画像は、中心体マーカーであるPLP（緑色）と微小管（赤色）で免疫染色した固定S2細胞、および染色体（青色）で染色した様子を示しています。固定および免疫染色の前に、細胞をコントロール、または紡錘体極の集束を促進するNCDA KINESIN様タンパク質をノックダウンするためのRNAiで4日間処理しました。NCD RNAiによる処理の結果、細胞に紡錘体極の広がりと紡錘体の不規則化が認められました。この手順を行う際は、培養皿に穴を開ける際に十分注意することが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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