Name: の準備ショウジョウバエ S2細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶショウジョウバエS2細胞の光学顕微鏡用前処理法。レクチンコーティングによる細胞接着と扁平化、固定・免疫染色の手順を解説。遺伝子機能解析や細胞構造の可視化に有用な実験プロトコルです。

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この作品は、国立がん研究所P30 CA23074、米国癌学会機関研究助成74-001-31、および大学によって部分的にサポートされていました。アリゾナGI SPORE（NCI / NIH CA9506O）の。

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞生物学の分野では、理想的なシステムは、維持するために安価な操作が容易、とのさまざまな技術に従順であろう。 ショウジョウバエ S2細胞がこれらの要件を満たすので、それらは急速に細胞の増加のために最適なシステムとなっている生物学研究所。 我々は、顕微鏡観察のためにS2細胞を準備する方法の概要を提示している。 S2細胞の顕著な美徳は、通常の大気中、室温でよく育つという事実であるため、彼らは特別なメンテナンスの必要なく、延長後の期間の顕微鏡に残さできます。それらは一般的にやや丸みを帯びた、通常の培養条件の下で緩く付着しているにもかかわらず、S2細胞が広範囲にイメージングのために平らに誘導することができる。コンカナバリンでプレコーティングしたガラスボトムディッシュ上で培養したS2細胞は、それらの優れた顕微鏡の標本作り、カバーガラス上に添付し、薄く広がっていく。

<table><tbody><tr><td>S2細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2細胞</td><td>DGRC</td><td>ストック番号 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2細胞</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>10%（最終濃度）の熱不活化FBSを添加して完全培地とする。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>100倍抗生物質溶液</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>ペニシリン (10000 U/mL)、&lt;br/&gt;ストレプトマイシン (10000 &amp;#x03BC;g/mL)、および&lt;br/&gt;アムホテリシンB (25 &amp;#x03BC;g/mL) を含有</td></tr><tr><td>コンカナバリンA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% 溶液</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>脱水、ACSグレード</td></tr><tr><td>モレキュラーシーブ</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>タイプ 3A</td></tr></tbody></table>

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> s2細胞

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

理想的な実験系では、さまざまな技法に従順維持するために、安価で簡単になる、と広範な文献とゲノム配列のデータベースでサポートされる。培養ショウジョウバエ S2細胞を、引き離さ20〜24時間齢の胚1の製品は、すべてのこれらの特性を有する。そのため、S2細胞は非常に分子プロセスのコンポーネントまたは関心のメカニズムをコードする遺伝子の発見を含む細胞プロセスの分析に適しています。それらのユーティリティのほとんどの責任があるS2細胞の特徴は、二本鎖（ds）RNAを介した干渉（RNAi）、および蛍光顕微鏡への従順さ、ライブまたは固定のどちらかのように彼らの絶妙な感度、それらが維持されると使いやすさです細胞。 S2細胞は、安価な、市販の、完全に定義されて、無血清培地2の数を含め、様々なメディアに成長させることができる。さらに、彼らは21〜24℃で最適にかつ迅速に成長し、コンテナの様々な培養することができる。哺乳動物細胞とは異なり、S2細胞は安定化の雰囲気を必要としませんが、代わりに通常の空気とよく行い、さらに密閉フラスコに維持することができる。 S2細胞にRNAi実験のしやすさを補完するのが容易に相または固定またはライブの細胞の蛍光顕微鏡で実験的に誘発された表現型を解析する機能です。 S2細胞は、単一の単層として培養中で成長が接触阻害を表示しません。その代わりに、細胞が密集培養物中のコロニーに成長する傾向がある。低密度で、S2の文化は、ラウンドと、ゆるやかに接続されているガラスまたは組織培養用プラスチック上に成長。しかし、S2細胞の細胞診は非常にレクチン、コンカナバリンA（ConA）3を塗布した面に一時的に培養することにより、広くフラット化して、それらを誘導することによって改善することができます。 S2細胞はまた、安定してライブまたは固定化細胞への関心のラベルの構造や細胞小器官への蛍光タグ付きマーカーをトランスフェクトすることができます。したがって、細胞の顕微鏡分析のための通常のシナリオはこうです：まず、S2細胞は（タグ付きマーカーを発現する導入遺伝子を保有することができます）標的タンパク質（s）を除去するためにRNAiにより扱われます。 RNAi処理時間は、蛋白質の違いは、速度オーバーターンと標的蛋白質が存続にとって重要である場合、セルの外傷/死を最小限に抑えるためにできるように調整することができます。次に、処理した細胞を分散させる細胞を誘導し、しっかりとガラスに付着する錯那でプレコーティングカバースリップを含む皿に移しています。最後に、細胞を顕微鏡モードの研究者の選択方式で撮像する。これらの細胞は通常の室温、大気中で健康を維持するので、S2細胞は生細胞の拡張された可視化を必要とする研究に特に適しています。

ショウジョウバエシュナイダー（S2）細胞は、遺伝子の発見と機能解析のためのますます普及システムです。私たちの目標は、このような重要性を増し、実験システムS2細胞を作る顕微鏡技術のいくつかを説明することです。

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> S2細胞

理想的な実験系とは、安価で維持が容易であり、さまざまな手法を適用でき、かつ膨大な文献による裏付けがあるものである。

本手順の全体的な目的は、光学顕微鏡観察に向けたDrosophila S2細胞の調製方法について説明することです。まず、ガラスボトム培養ディッシュを調製します。次に、そのガラスボトムをレクチンConvalでコーティングします。S2細胞の接着と平坦化を促進します。手順の3番目のステップは、培養液とS2細胞を培養皿に添加することです。手順の最終ステップは、培養皿内のS2細胞を固定し、免疫染色することです。最終的に、生細胞または固定されたS2細胞の蛍光顕微鏡観察を通じて、それぞれfluoro fourでタグ付けされた、あるいは免疫標識された目的タンパク質の局在を示す結果を得ることができます。アリゾナ大学細胞生物学・解剖学部門のGreg Rogers研究室のJoey Clubです。同じくRogers研究室のJohn Nyeです。そして、私はダン・バスターです。グレッグ・ロジャースの研究室に所属しています。本日は、光学顕微鏡観察に向けてDrosophila S2細胞を準備する手順をご紹介します。当研究室では、重要な調節タンパク質の除去または過剰発現後の中心粒数と構造の変化を調べることで、Drosophilaにおける中心体重複の調節を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。ガラス底ディッシュの作成には、標準的な35 mmペトリ皿を使用します。これらのガラスボトムディッシュは、細胞を通常の培養条件に非常に近い状態で保持できるだけでなく、顕微鏡グレードのガラスを通して生細胞を観察することを可能にします。ガラスボトムディッシュを組み立てる際は、厚壁の発泡スチロール箱にテープを貼った表面を穴あけ面として使用します。35 mmペトリ皿の下半分を、皿の底面が発泡スチロール箱に接するように穴あけ面上に置き、皿の両端をしっかりと固定しながら、3/4インチのスペードビットを装着したハンドドリルを使用して、皿に穴を開けます。すべてのディッシュへの穴あけが完了した後、粗目の粒度で直径がスパードリルと同程度の円錐形グラインディングビットを使用して、穴の外側の縁を滑らかにします。電動ドリルの本体を横にし、ビットがカウンターの端から突き出すように配置します。10 kgの砂を入れた丈夫なプラスチック袋など、重量がありつつ柔軟なものをドリル上に置いて固定してください。ドリルを連続して動作させるには、ロックオンボタンを使用してください。ディッシュを保持しながら研削ビットに押し当てて動かし、新しく開けた穴の粗い縁を滑らかに整えます。穴の外縁が滑らかになった後、ディッシュの底部を大きなビーカーに入れ、蒸留水で数回すすいでください。これにより、後で浮上してくるプラスチックやスチロフォームの小さな破片を取り除くことができます。ディッシュの底を並べて乾燥させます。ディッシュが乾いたら、Sa

preparation-of-drosophila-s2-cells-for-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ライブイメージング解析のためのショウジョウバエの胚を作製する、シンプルで安価な、そして効果的な方法が提示される。我々のプロトコルは、湿度およびガス交換を提供し、ショウジョウバエの胚を圧縮しません。このメソッドは、実体顕微鏡や正立複合顕微鏡を用いてショウジョウバエの胚のGFPベースのライブイメージングに適しています。...

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このプロトコルは、次の3つについて説明します...

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ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。...

培養中の細胞小器官輸送ショウジョウバエ細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

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学ぶショウジョウバエS2細胞の光学顕微鏡用前処理法。レクチンコーティングによる細胞接着と扁平化、固定・免疫染色の手順を解説。遺伝子機能解析や細胞構造の可視化に有用な実験プロトコルです。

の準備ショウジョウバエ S2細胞

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