生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換

本実験の全体的な目的は、蛍光タンパク質M orangeおよびtwo andronを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングにより、4つの個別の細胞集団または細胞内コンパートメントを選択的に標識することです。これはまず、低強度の488 nanometer励起光を細胞に照射して、すべてのgreen drawn per蛍光をオフにすることで達成されます。第2ステップとして、細胞を高強度の488 nanometer励起光にさらすことで、m orange蛍光を赤色に光変換させます。

次に、二光子励起による蛍光をオンにするため、細胞に800 nanometerの二光子励起を照射します。ここでも、M Orange twoとdrawn ppaを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングに基づき、細胞を4つの異なる組み合わせでラベル化することが可能であるという結果が得られました。サブセルラー分画などの既存の実験手法に対する本手法の主な利点は、生細胞を用いて行われることです。

この手法は、なぜインスリン小胞のごく一部しか分泌されないのかといった、β細胞生物学における重要な疑問への回答に役立ちます。本手順はβ細胞の機能に関する知見を提供しますが、他の系にも応用可能です。例えば、がん細胞のin vivoでの追跡などが挙げられます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、水相に蛍光タンパク質を含む1液滴水エマルションで構成されます。

このエマルションを顕微鏡スライドガラスと22 mm四方のカバーガラスで挟み込み、顕微鏡観察に使用します。この手順を開始する前に、スライドガラスとカバーガラスを洗浄し、疎水性剤でコーティングする必要があります。ガラス器具をアセトンで5分間洗浄して清浄にします。

洗浄後、ガラス器具を自然乾燥させます。次に、アセトンを用いて2% methyl trimeth oxy seline溶液を調製し、ガラス器具をこの溶液に2分間浸してコーティングします。コーティング後、ガラス器具を溶液から取り出し、乾燥させます。

次に、スプレーボトルを用いてガラス器具を70% ethanolで洗浄します。洗浄後、再びガラス器具を自然乾燥させ、残った液体を取り除きます。加圧空気を使用すれば、コーティングしたガラス器具を少なくとも1か月間保存することが可能です。

ガラス器具の準備が完了したら、あらかじめ大腸菌からHisタグ付きタンパク質として精製しておいた蛍光タンパク質を用意します。精製タンパク質の吸収スペクトルを測定してください。0.1%牛血清アルブミンを含むpH 8のTris緩衝生理食塩水を用いて、吸光度がおよそ0.1になるようにストック希釈液を調製します。

さらに、15 mLのコニカルチューブに1-octanolとtris buffered saline solutionを1:1の割合で10 mL調製し、激しく混合します。混合後、相分離が完了するまで静置します。上層がoctanolとなります。エマルションを作成するため、45 µLの1-octanolと5 µLの蛍光タンパク質をEppendorfチューブにピペットで分注します。

チューブを数回タッピングしてエマルションの形成を開始させ、その後、超音波洗浄機でチューブを30秒間ソニケーションします。その間に、ソニケーション後の手順に従って、コーティング済みの顕微鏡スライドガラスとカバーガラスを準備します。エマルションは完全に濁っているはずです。

直ちに、チューブの中央から4 µLのエマルションをピペットでコート済み顕微鏡スライドガラスに取り、コート済みカバーガラスで覆います。エマルションが顕微鏡スライドガラスとカバーガラスの間に均一に広がるようにしてください。数分以内に、サンプルが安定します。

以下の手順は、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の光変換実験をセットアップするための一般的な戦略です。この手順は、精製タンパク質および生細胞の両方に適用可能です。本実験では、光変換実験の一般的な出発点として、精製したmOrange2タンパク質を含む液滴サンプルを使用します。

共焦点レーザー走査顕微鏡を次のように設定します。40倍、開口数1.3の油浸対物レンズを使用し、画像サイズを512×512ピクセルに設定します。ピクセル滞在時間を6 µsに設定し、ズームを4倍にし、ピンホールの大きさを調整してZ方向の分解能を3 µmにします。

初期蛍光および光変換後の蛍光のための2つの検出チャネルと、光変換用チャネルを構成します。561 nmの励起光を用いてオレンジ色の種を観察し、570 nmから630 nmの間の蛍光を収集します。633 nmの励起光を用いて光変換された赤色の種を検出し、640 nmから700 nmの間の蛍光を収集します。

光変換チャネルについては、488 nmのレーザーラインを選択し、490から540 nmの間の蛍光を収集してください。イメージングにおいて、光変換チャネルは必須ではありませんが、有用な場合があります。実験を開始するには、検出器チャネルを用いて初期蛍光を連続スキャンでイメージングし、最適な画像品質になるようにレーザー出力と検出器ゲインを調整してください。

次に、光変換チャネルを活性化し、低レーザー出力を選択します。タイムラプス連続撮影を開始し、初期蛍光の顕著な退色（ブリーチング）が観察されるまで、光変換レーザーを徐々に上げていきます。初期蛍光が約75%退色するまでスキャンを継続します。

次に、光変換チャンネルを不活性化し、光変換された蛍光の検出チャンネルを活性化します。低いレーザー出力で、検出器ゲインを高く設定してイメージングを開始してください。その後、光変換された蛍光が検出されるまで、徐々にレーザー出力を上げていきます。

検出後、最適な画質を得るためにレーザー強度またはゲインを調整します。最後に、光変換に使用するレーザー強度とその照射時間を最適化します。レーザー強度を高めると、光変換の速度が加速します。

しかしながら、レーザー出力が高すぎるとタンパク質が光退色してしまいます。最適な光変換、レーザー出力、および照射時間が決定すれば、これらのパラメータを用いて標準的な光退色モジュールまたは光退色後蛍光回復（FRAP）モジュールを設定することが可能です。その後は、M orange twoのレッドシフトという分光学的特性により、光変換チャネルは不要になります。

これは、デュアルプローブ光学ハイライティングのために、PUとして描かれたグリーン光スイッチング蛍光タンパク質と組み合わせて使用できます。デュアルプローブ光学ハイライティングを開始するには、まずHeLa細胞をガラス底MatTekディッシュで培養し、イメージングの24時間前に、標準的なLipofectamine 2000トランスフェクションを用いて、蛍光タンパク質をコードするプラスミドを細胞に導入します。

生細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡に設置し、前述の方法に従ってM orange two光変換のための顕微鏡設定を行います。次に、DPA光スイッチングの設定を行います。DPAは488 nanometerの光で励起され、その蛍光はM orange two光変換チャンネルを用いてイメージングすることが可能です。

MPAのイメージングに使用するレーザー出力は、過剰な出力がmpaの不活化を引き起こすため、最小限に抑えてください。800 nmの二光子励起を用いたMPA光活性化用のチャンネルを追加します。その後、光活性化およびOFA蛍光の光不活化のイメージングに必要なレーザー出力を決定します。

この手順において最も困難な点の一つは、M orangeを光変換させることなくRPAを不活性化させることです。なぜなら、どちらの現象も同じ波長で起こるためです。これを防ぐためには、光変換を慎重に最適化することが非常に重要です。

レーザー出力および照射時間。mOrange2の光変換とPUの不活性化の両方が488 nmの光励起によって起こるため、注意が必要です。mOrange2の顕著な光変換を起こさずにPUを不活性化させる必要があります。mOrange2の光変換およびDPAの光スイッチングのパラメータが設定された後は、より低いレーザー出力を使用してください。

デュアルプローブ光学的ハイライティングが可能です。まず、低出力の488 nanometer励起を用いて、視野全体でDPAの蛍光を不活性化させます。次に、関心領域（ROI）を選択し、高出力の488 nanometer励起によってmOrange2を変換させます。

最後に、関心領域を選択し、800 nmの二光子励起を用いてDPA蛍光を活性化させます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、共焦点顕微鏡による光変換アプリケーションの構築に最適です。液滴サンプルが正しく調製されていれば、液滴は非常に均質に見えます。

しかし、顕微鏡スライドガラスにカバーガラスを使用せずにサンプルを調製すると、調製されたサンプルにおいて液滴がガラス表面のいずれかに押し潰される傾向があります。0.1% BSAが存在しない場合、蛍光タンパク質は一方の水界面に蓄積しやすくなります。蛍光光変換によるハローの形成は、レーザー出力と露光時間に決定的に依存します。

レーザー出力が強すぎるか、露光時間が長すぎると光退色が起こり、光変換された赤色蛍光の減少を招きます。M orange twoとPHOの明確なスペクトル特性により、光変換前に2種類のプローブで光学的なハイライトを行うことが可能です。M orange two、histone H two B、およびDPA mitoを発現している細胞では、核にオレンジ色蛍光が、ミトコンドリアに緑色蛍光が認められます。低出力の488 nanometer励起によってすべての蛍光を消灯させた場合、M orangeの光変換は最小限に抑えられます。

M orange twoは、高出力の488 nanometer励起により赤色へと光変換させることができます。M orange twoが光変換された後、800 nanometerの2光子励起を用いることで、再び蛍光をオンにすることが可能です。このデュアルプローブによる光学的ハイライティングを用いることで、細胞を4つの異なる方法で標識できます。

この手法を用いることで、4つの異なる細胞集団を特異的に標識することが可能です。これまでに見てきたように、この手順において最も困難な点の一つは、m orangeを光変換させずにMPAを不活性化することです。この操作を習得すれば、例えば膵β細胞における複数の集団の追跡など、本システムを用いたさらなる実験を行うことができます。

以上です。このプレゼンテーションがお役に立てば幸いです。皆様の実験の成功をお祈りいたします。