Name: 生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ蛍光タンパク質mOrange2とDronpaを用いたデュアルプローブ光の強調表示法。生細胞で4つの異なる細胞集団を選択的に標識し、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使った光変換技術を習得できます。

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我々は、蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを提供するためのマイクW.ダビッドソン（フロリダ州立大学）を感謝。この作品は、厚生助成金GM72048（DWPへ）の国立研究所によってサポートされていました。

1。蛍光タンパク質の液滴の試料の調製蛍光タンパク質の液滴のサンプルでは、​​水相内に存在する蛍光タンパク質と1 - オクタノールのエマルジョンで構成されています。このエマルジョンは、顕微鏡のアプリケーションのための顕微鏡スライド、22 mm角のカバーガラスの間に挟まれている。 <ol><li>蛍光タンパク質の液滴のサンプルを作る前に、顕微鏡スライドとカバーガラスは、疎水化剤で洗浄し、コーティングする必要があります。 </li><li>アセトンで5分間洗浄することによりガラスを清掃し、空気が乾燥しておきます。 （オプションで、ガラス製品を洗浄した後、最適なコーティングの結果を得るために、プラズマクリーナーで30秒間処理することができる）。 </li><li>この溶液中で2分間のインキュベーション中に、アセトンとコートガラス製品では2％メチル溶液を調製します。コー​​ティング後、溶液からガラスを取り除き、空気が乾燥しておきます。その後、スプレーボトルから70％エタノールで洗浄し、再び乾燥させておきます。 （オプションで、この時点でガラスは° Cの共有結合ガラスにコーティングをリンクするために80℃1時間焼成することができます）。コー​​ティングされたガラス製品は、少なくとも一ヶ月間保存することができます。 </li><li>蛍光タンパク質は、E.から彼の6 -タグ融合タンパク質として精製されていますコリ 1。精製されたタンパク質の吸光度スペクトルを測定し、STEバッファー（150mMのNaCl、10mMトリス- HCl pH8の、1mMのEDTA）で〜0.1の光学密度と株式の希薄化を準備、0.1％ウシ血清アルブミンを含む（BSA） 。加えて15 mlコニカルチューブ中の1 - オクタノールとSTEバッファーの1:1混合物の10mlを準備し、積極的に混ぜる。相分離が完了するまで、休暇を混合した後。上部相は、1 - オクタノールです。 （注意：1 - オクタノールは、強い香りを持っているので、それは1 - オクタノールと接触するすべてのもののために密閉廃棄物の容器を使用することが重要です。） </li><li>エマルジョンピペット45μlの1 - オクタノールとマイクロチューブに5μlの蛍光タンパク質を作るまで。エマルジョンの形成を開始してから、超音波浴中で30秒間チューブを超音波処理するために、指でチューブを数回タップします。で一方、コーティングされた顕微鏡スライドとカバーガラスの準備をする。超音波処理した後にエマルジョンは完全に曇りにする必要があります。すぐにコーティングされた顕微鏡スライド上に管の途中から超音波ピペット4μlのエマルジョンの後、コーティングされたカバーガラスで覆う。 </li><li>手続きが行われている場合、正しくエマルジョンは、顕微鏡のスライドとオブジェクトのガラスの間に均等に分散する必要があります。分以内にサンプルの直径を変えて〜10μmの厚さの蛍光滴から成る、安定している必要があります。最大の液滴は、試料の中心に近く、小さい方は、エッジに向かってさらに配置されています。 </li></ol> 2。光電変換実験のセットアップ次の手順では、蛍光タンパク質の光電変換テストを設定するための一般的な戦略です。この手順は、生きている細胞のためだけでなく、タンパク質の精製に適用することができます。 <ol><li>以下のパラメータは、光変換の実験を設定する一般的な出発点を提供します。 40倍1.3NA油浸対物レンズ 画像サイズ= 512 × 512ピクセル スキャンズーム= 4 ピクセルは、時間= 6マイクロ秒に住む。 Z -解像度（ピンホールのサイズ）= 3μmの</li><li>初期とphotoconverted蛍光だけでなく、"光電変換チャネル"の2つの検出チャンネルを設定します。この例ではオレンジ色から赤色photoconvertible蛍光タンパク質であるmOrange2タンパク質を、精製された使用します。オレンジ色の種は、561 nmの励起を用いて検出されると蛍光を570 nmと630nmの間に収集されます。 photoconverted赤い種は、633nmの励起を用いて検出されると蛍光が640 nmと700 nmの間に収集されます。 "光電変換チャネル"のために488 nmの励起を選択し、490nmのと540nmの間に蛍光を収集する。 （注：イメージング光電変換チャネルは、必ずしも必要ではありません。） </li><li>イメージングレーザパワーと、最適な画像品質のための検出器のゲインを調整するために連続スキャンと初期の蛍光のチャネルを使用してください。 </li><li>光電変換チャネルをアクティブにし、低レーザパワーを選択。撮影時間の経過のシリーズを起動し、初期の蛍光の漂白著しいが観察されるまで徐々に光電変換レーザーを増加させる。初期の蛍光が約75％漂白になるまでスキャンを続行。 </li><li>光電変換チャネルを停止し、photoconverted蛍光の検出チャンネルをアクティブにします。高い検出器のゲインと低レーザパワーとイメージングを起動し、photoconverted蛍光が検出されるまで徐々にレーザーパワーを増加させる。一度あなたがレーザーのパワーと、最適な画像品質のための検出器のゲインを調整することができますphotoconverted蛍光を検出する。 </li><li>最後に、レーザパワーは、使用光変換だけでなく、光変換の持続のために最適化する必要があります。光電変換レーザパワーを増加させると、光変換の速度を加速する、しかしあまりにも多くのレーザパワーは、タンパク質を退色されます。 </li><li>一度、最適な光変換レーザーのパワーと持続時間が決定されている、これらのパラメータは標準の光退色やFRAPモジュールを構成するために使用することができ、"光電変換チャネルは、"不要になります。 </li></ol> 3。 mOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライトために赤方偏移したスペクトル特性から、mOrange2は、4個のセル（オルガネラ）の集団を選択的に強調表示を可能にするデュアルプローブ光学ハイライトのための緑のphotoswitchable蛍光タンパク質Dronpa（ドロンパ）と組み合わせて使用​​することができます。 <ol><li>細胞をガラス底マテック皿に成長し、標準Lipofectamine2000トランスフェクション1を使用して撮影する前に24時間トランスフェクトされる。 </li><li>としてセクション2で説明mOrange2光変換用の顕微鏡を設定します。 </li><li>ドロンパのphotoswitching用顕微鏡を設定します。ドロンパの蛍光がmOrange2"光電変換チャネルを"（ステップ2.2参照）を使用して画像化することができます。 （注意：あまりにも多くのレーザーパワーがドロンパの不活化の原因となりますので、画像ドロンパのために使用されるレーザーパワーを最小化。）ドロンパの光活性化のためのチャネルを追加します。我々は、光活性化のために800nm​​の二光子励起を使用しますが、代わりにこれを405nmの励起を用いて達成することができます。イメージング、光活性化、そしてドロンパ蛍光の光不活性化するために必要なレーザーパワーを決定します。 </li><li>注意：mOrange2の光変換とドロンパの不活性化は、両方とも488 nmの励起によって起こる。このためにも、ドロンパの蛍光を不活性化するmOrange2光変換に必要な高いレーザーパワーの。一方、ドロンパの不活性化は非常に低いレーザーパワーで既に発生し、大幅なmOrange2光変換することなく行うことができます。 </li><li> mOrange2光変換し、ドロンパのphotoswitchingのパラメータを設定したら、デュアルプローブ光学ハイライトは以下の手順によって実現されます。最初に、低消費電力488 nmの励起で視野全体でドロンパの蛍光を不活性化する。第二に、ハイパワー488 nmの励起との利益とphotoconvert mOrange2の領域を選択します。最後に、ドロンパの蛍光をアクティブにするために関心領域を選択します。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。液滴試料調製を。）正しく滴のサンプルを用意した。 B）サンプルはコーティング顕微鏡スライドとカバーガラスなしで準備。 C）サンプルは、0.1％BSAを添加することなく準備。 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 mOrange2タンパク質を含むmOrange2光変換で光電変換レーザーのパワーと持続時間の影響。単一液滴が連続して488 nmのレーザパワーの異なる量を使用してphotoconvertedていた。光変換のために使用される相対的なレーザーパワーが10％（固形）、25％（破線）、および100％（点線）であった。 A）オレンジ蛍光種。 B）Photoconverted赤色蛍光種。 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 mOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライト。ミトコンドリアの核と緑色蛍光のオレンジ色の蛍光を示す光変換前mOrange2 -ヒストンH2Bとドロンパ-水戸の発現）細胞、。 B）ドロンパの蛍光がmOrange2の最小限の光変換を引き起こし、低消費電力488 nmの励起をオフにした。 C）mOrange2は、高出力488nmの励起で赤色にphotoconvertedした。 D）ドロンパの蛍光は再び800nm​​の2光子励起を使用してオンにした。パネルは、微分干渉コントラスト画像と一緒に蛍光画像のオーバーレイです。

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

精製した蛍光タンパク質の液滴のサンプルでは、​​光退色反応速度論と光電変換反応速度を研究するために、例えば、蛍光タンパク質の光物理的特性評価のための非常に便利なサンプルフォーマットです。非常に小さな液滴の体積（〜20ピコリットル）のキュベットベースのシステムで実行することが困難な場合も退色や光変換の実験を、容易に。ここに示されているように加えて、液滴のサンプルは、理想的に光電変換アプリケーションのための共焦点顕微鏡をセットアップするために適しています。疎水性コーティングとBSAの存在は、均一な液滴を得るために重要である。コー​​ティングすることなく液滴はガラス表​​面のいずれかに対して押しつぶさになる傾向があり、BSAの存在下で蛍光タンパク質は、蛍光のにじみ（図1）を作成し、1 - オクタノールのインタフェースに蓄積する傾向がある。 蛍光タンパク質の光変換は、しばしば一つもphotoconverted種を追うことができるという利点と、光退色後の蛍光回復（FRAP）の代替とみなされている。しかし、その光変換が使用されるレーザパワーに決定的に依存して検討することが重要です。あまりにも多...

<table><tbody><tr><td>顕微鏡スライドグラス</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>22 mm カバーガラス</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-オクタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>メチルトリメトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>MatTek ディッシュ</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible蛍光タンパク質は、（PC - FPS）蛍光の色が特定の波長の光への曝露によって変更することができることを意味する、&quot;光学式ハイライト&quot;機能を持つ蛍光タンパク質のクラスです。光の強調表示は、非侵襲的蛍光分子の集団をマークすることを許可されているので、単一の細胞または細胞小器官を追跡するのに最適です。 効率的な光変換のための重要なパラメータは、光電変換光の強度と露光時間です。強度が低すぎる場合、光変換は全く発生が遅いかどうかになります。一方、多すぎる強度や長すぎる露出は、タンパク質の光退色し、それによって光変換の効率を減らすことができます。 このプロトコルは、どのようにPC - FPの光電変換アプリケーションのための共焦点レーザー走査型顕微鏡を設定する一般的なアプローチを説明します。まず、精製されたタンパク質の液滴の試料を調製するための手順を説明します。このサンプルフォーマットには、顕微鏡下で蛍光タンパク質の光物理的挙動を研究するために非常に便利です。第二に、我々は、光変換用の顕微鏡を構成する方法を示すために蛋白質の液滴のサンプルを使用します。そして最後に、我々はmOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライトを含む生きている細胞の光学強調表示、実行する方法を説明します。

このプロトコルは、共焦点レーザー走査型顕微鏡に蛍光タンパク質の光変換を実行するための一般的なアプローチを説明します。我々はpuriedタンパク質試料の光変換用だけでなく、mOrange2とドロンパと、生細胞におけるデュアルプローブ光学ハイライトするための手順を説明します。

光変換性蛍光タンパク質（pc-FP）は、「光学ハイライター」機能を備えた蛍光タンパク質の一種であり、これは...の色を（変化させられることを）意味します。

本実験の全体的な目的は、蛍光タンパク質M orangeおよびtwo andronを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングにより、4つの個別の細胞集団または細胞内コンパートメントを選択的に標識することです。これはまず、低強度の488 nanometer励起光を細胞に照射して、すべてのgreen drawn per蛍光をオフにすることで達成されます。第2ステップとして、細胞を高強度の488 nanometer励起光にさらすことで、m orange蛍光を赤色に光変換させます。次に、二光子励起による蛍光をオンにするため、細胞に800 nanometerの二光子励起を照射します。ここでも、M Orange twoとdrawn ppaを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングに基づき、細胞を4つの異なる組み合わせでラベル化することが可能であるという結果が得られました。サブセルラー分画などの既存の実験手法に対する本手法の主な利点は、生細胞を用いて行われることです。この手法は、なぜインスリン小胞のごく一部しか分泌されないのかといった、β細胞生物学における重要な疑問への回答に役立ちます。本手順はβ細胞の機能に関する知見を提供しますが、他の系にも応用可能です。例えば、がん細胞のin vivoでの追跡などが挙げられます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、水相に蛍光タンパク質を含む1液滴水エマルションで構成されます。このエマルションを顕微鏡スライドガラスと22 mm四方のカバーガラスで挟み込み、顕微鏡観察に使用します。この手順を開始する前に、スライドガラスとカバーガラスを洗浄し、疎水性剤でコーティングする必要があります。ガラス器具をアセトンで5分間洗浄して清浄にします。洗浄後、ガラス器具を自然乾燥させます。次に、アセトンを用いて2% methyl trimeth oxy seline溶液を調製し、ガラス器具をこの溶液に2分間浸してコーティングします。コーティング後、ガラス器具を溶液から取り出し、乾燥させます。次に、スプレーボトルを用いてガラス器具を70% ethanolで洗浄します。洗浄後、再びガラス器具を自然乾燥させ、残った液体を取り除きます。加圧空気を使用すれば、コーティングしたガラス器具を少なくとも1か月間保存することが可能です。ガラス器具の準備が完了したら、あらかじめ大腸菌からHisタグ付きタンパク質として精製しておいた蛍光タンパク質を用意します。精製タンパク質の吸収スペクトルを測定してください。0.1%牛血清アルブミンを含むpH 8のTris緩衝生理食塩水を用いて、吸光度がおよそ0.1になるようにストック希釈液を調製します。さらに、15 mLのコニカルチューブに1-octanolとtris buffered saline solutionを1:1の割合で10 mL調製し、激しく混合します。混合後、相分離が完了するまで静置します。上層がoctanolとなります。エマルションを作成するため、45 µLの1-octanolと5 µLの蛍光タンパク質をEppendorfチューブにピペットで分注します。チューブを数回タッピングしてエマルションの形成を開始させ、その後、超音波洗浄機でチューブを30秒間ソニケーションします。その間に、ソニケーション後の手順に従って、コーティング済みの顕微鏡スライドガラスとカバーガラスを準備します。エマルションは完全に濁っているはずです。直ちに、チューブの中央から4 µLのエマルションをピペットでコート済み顕微鏡スライドガラスに取り、コート済みカバーガラスで覆います。エマルションが顕微鏡スライドガラスとカバーガラスの間に均一に広がるようにしてください。数分以内に、サンプルが安定します。以下の手順は、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の光変換実験をセットアップするための一般的な戦略です。この手順は、精製タンパク質および生細胞の両方に適用可能です。本実験では、光変換実験の一般的な出発点として、精製したmOrange2タンパク質を含む液滴サンプルを使用します。共焦点レーザー走査顕微鏡を次のように設定します。40倍、開口数1.3の油浸対物レンズを使用し、画像サイズを512×512ピクセルに設定します。ピクセル滞在時間を6 µsに設定し、ズームを4倍にし、ピンホールの大きさを調整してZ方向の分解能を3 µmにします。初期蛍光および光変換後の蛍光のための2つの検出チャネルと、光変換用チャネルを構成します。561 nmの励起光を用いてオレンジ色の種を観察し、570 nmから630 nmの間の蛍光を収集します。633 nmの励起光を用いて光変換された赤色の種を検出し、640 nmから700 nmの間の蛍光を収集します。光変換チャネルについては、488 nmのレーザーラインを選択し、490から540 nmの間の蛍光を収集してください。イメージングにおいて、光変換チャネルは必須ではありませんが、有用な場合があります。実験を開始するには、検出器チャネルを用いて初期蛍光を連続スキャンでイメージングし、最適な画像品質になるようにレーザー出力と検出器ゲインを調整してください。次に、光変換チャネルを活性化し、低レーザー出力を選択します。タイムラプス連続撮影を開始し、初期蛍光の顕著な退色（ブリーチング）が観察されるまで、光変換レーザーを徐々に上げていきます。初期蛍光が約75%退色するまでスキャンを継続します。次に、光変換チャンネルを不活性化し、光変換された蛍光の検出チャンネルを活性化します。低いレーザー出力で、検出器ゲインを高く設定してイメージングを開始してください。その後、光変換された蛍光が検出されるまで、徐々にレーザー出力を上げていきます。検出後、最適な画質を得るためにレーザー強度またはゲインを調整します。最後に、光変換に使用するレーザー強度とその照射時間を最適化します。レーザー強度を高めると、光変換の速度が加速します。しかしながら、レーザー出力が高すぎるとタンパク質が光退色してしまいます。最適な光変換、レーザー出力、および照射時間が決定すれば、これらのパラメータを用いて標準的な光退色モジュールまたは光退色後蛍光回復（FRAP）モジュールを設定することが可能です。その後は、M orange twoのレッドシフトという分光学的特性により、光変換チャネルは不要になります。これは、デュアルプローブ光学ハイライティングのために、PUとして描かれたグリーン光スイッチング蛍光タンパク質と組み合わせて使用できます。デュアルプローブ光学ハイライティングを開始するには、まずHeLa細胞をガラス底MatTekディッシュで培養し、イメージングの24時間前に、標準的なLipofectamine 2000トランスフェクションを用いて、蛍光タンパク質をコードするプラスミドを細胞に導入します。生細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡に設置し、前述の方法に従ってM orange two光変換のための顕微鏡設定を行います。次に、DPA光スイッチングの設定を行います。DPAは488 nanometerの光で励起され、その蛍光はM orange two光変換チャンネルを用いてイメージングすることが可能です。MPAのイメージングに使用するレーザー出力は、過剰な出力がmpaの不活化を引き起こすため、最小限に抑えてください。800 nmの二光子励起を用いたMPA光活性化用のチャンネルを追加します。その後、光活性化およびOFA蛍光の光不活化のイメージングに必要なレーザー出力を決定します。この手順において最も困難な点の一つは、M orangeを光変換させることなくRPAを不活性化させることです。なぜなら、どちらの現象も同じ波長で起こるためです。これを防ぐためには、光変換を慎重に最適化することが非常に重要です。レーザー出力および照射時間。mOrange2の光変換とPUの不活性化の両方が488 nmの光励起によって起こるため、注意が必要です。mOrange2の顕著な光変換を起こさずにPUを不活性化させる必要があります。mOrange2の光変換およびDPAの光スイッチングのパラメータが設定された後は、より低いレーザー出力を使用してください。デュアルプローブ光学的ハイライティングが可能です。まず、低出力の488 nanometer励起を用いて、視野全体でDPAの蛍光を不活性化させます。次に、関心領域（ROI）を選択し、高出力の488 nanometer励起によってmOrange2を変換させます。最後に、関心領域を選択し、800 nmの二光子励起を用いてDPA蛍光を活性化させます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、共焦点顕微鏡による光変換アプリケーションの構築に最適です。液滴サンプルが正しく調製されていれば、液滴は非常に均質に見えます。しかし、顕微鏡スライドガラスにカバーガラスを使用せずにサンプルを調製すると、調製されたサンプルにおいて液滴がガラス表面のいずれかに押し潰される傾向があります。0.1% BSAが存在しない場合、蛍光タンパク質は一方の水界面に蓄積しやすくなります。蛍光光変換によるハローの形成は、レーザー出力と露光時間に決定的に依存します。レーザー出力が強すぎるか、露光時間が長すぎると光退色が起こり、光変換された赤色蛍光の減少を招きます。M orange twoとPHOの明確なスペクトル特性により、光変換前に2種類のプローブで光学的なハイライトを行うことが可能です。M orange two、histone H two B、およびDPA mitoを発現している細胞では、核にオレンジ色蛍光が、ミトコンドリアに緑色蛍光が認められます。低出力の488 nanometer励起によってすべての蛍光を消灯させた場合、M orangeの光変換は最小限に抑えられます。M orange twoは、高出力の488 nanometer励起により赤色へと光変換させることができます。M orange twoが光変換された後、800 nanometerの2光子励起を用いることで、再び蛍光をオンにすることが可能です。このデュアルプローブによる光学的ハイライティングを用いることで、細胞を4つの異なる方法で標識できます。この手法を用いることで、4つの異なる細胞集団を特異的に標識することが可能です。これまでに見てきたように、この手順において最も困難な点の一つは、m orangeを光変換させずにMPAを不活性化することです。この操作を習得すれば、例えば膵β細胞における複数の集団の追跡など、本システムを用いたさらなる実験を行うことができます。以上です。このプレゼンテーションがお役に立てば幸いです。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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