生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換

本実験の全体的な目的は、蛍光タンパク質M orangeとtwo andronを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングにより、4つの個別の細胞集団または細胞内コンパートメントを選択的にラベル化することです。これはまず、低強度の488 nanometer励起光を細胞に照射して、すべてのgreen drawn per蛍光をオフにすることで達成されます。第2のステップとして、細胞を高強度の488 nanometer励起光にさらすことで、m orangeの蛍光を赤色に光変換させます。

次に、デュアル蛍光をオンにするために、細胞に800 nmの二光子励起を照射します。ここでも、M Orange 2とdral-ppaを用いたデュアルプローブ光学的ハイライティングに基づき、4つの異なる組み合わせで細胞をラベル化できるという結果が得られました。サブセルラー分画法のような既存の実験手法に対する本手順の主な利点は、生細胞を用いて行われる点にあります。

この手順は、インスリン小胞のごく一部しか分泌されない理由など、ベータ細胞生物学における重要な疑問を解明するのに役立ちます。この手順はベータ細胞の機能に関する知見を提供しますが、他のシステムにも適用可能です。例えば、生体内でのがん細胞の追跡などが挙げられます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、水相に蛍光タンパク質が含まれたO/Wエマルションで構成されています。

このエマルションを顕微鏡スライドガラスと22 mm角のカバーガラスで挟み、顕微鏡観察に用います。この手順を開始する前に、スライドガラスとカバーガラスを洗浄し、疎水剤でコーティングする必要があります。ガラス器具をアセトンで5分間洗浄して清浄にします。

洗浄後、ガラス器具を風乾させます。次に、アセトンで2%メチルトリメトキシシラン溶液を調製し、ガラス器具をその溶液に2分間浸してコーティングします。コーティング後、ガラス器具を溶液から取り出し、乾燥させます。

次に、スプレーボトルを用いてガラス器具を70% ethanolで洗浄します。洗浄後、再びガラス器具を自然乾燥させ、残っている液体を除去します。加圧空気を使用して乾燥させれば、コーティング済みのガラス器具を少なくとも1ヶ月間保存することが可能です。

ガラス器具の準備が完了したら、あらかじめ大腸菌からhisタグ付きタンパク質として精製しておいた蛍光タンパク質を用意します。精製タンパク質の吸収スペクトルを測定してください。0.1%牛血清アルブミンを含むpH 8のTris緩衝生理食塩水を用いて、吸光度が約0.1となるようにストック希釈液を調製します。

さらに、15 mLコニカルチューブに1-octanolとtris buffered saline solutionを1:1の割合で計10 mL調製し、激しく混合します。混合後、相分離が完了するまで静置します。上層がoctanolとなります。エマルションを作成するため、45 µLの1-octanolと5 µLの蛍光タンパク質をEppendorfチューブにピペットで分注します。

チューブを数回軽く叩いてエマルションの形成を開始させ、その後、超音波洗浄機で30秒間ソニケーションを行います。その間に、ソニケーション後の手順に従って、コート済み顕微鏡スライドガラスとカバーガラスを準備します。エマルションは完全に白濁しているはずです。

直ちに、チューブの中央から4 µLのエマルションをピペットでコート済み顕微鏡スライドガラス上に取り、コート済みカバーガラスで覆います。エマルションが顕微鏡スライドガラスとカバーガラスの間に均一に広がるようにしてください。数分以内にサンプルが安定します。

以下の手順は、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の光変換実験を行うための一般的な戦略です。この手順は、精製タンパク質および生細胞の両方に適用可能です。本実験では、光変換実験の一般的な出発点として、精製mOrange2タンパク質を含む液滴試料を使用します。

共焦点レーザー走査顕微鏡を次のように設定します。40倍、開口数 1.3 の油浸対物レンズを使用し、画像サイズを 512 × 512 ピクセルに設定します。ピクセル滞在時間を 6 µs に、ズームを 4 に設定し、Z 分解能が 3 µm になるようピンホール径を調整します。

初期蛍光および光変換後の蛍光のための2つの検出チャネルと、光変換用チャネルを設定します。561 nmの励起光を用いてオレンジ色の種を観察し、570 nmから630 nmの間の蛍光を収集します。633 nmの励起光を用いて光変換された赤色の種を検出し、640 nmから700 nmの間の蛍光を収集します。

フォトコンバージョンチャンネルについては、488 nanometerのレーザーラインを選択し、490から540 nanometerの間の蛍光を収集します。フォトコンバージョンチャンネルは厳密には必須ではありませんが、有用な場合があります。実験を開始するには、検出器チャンネルを使用して、連続スキャンによる初期蛍光のイメージングを行い、最適な画像品質が得られるようにレーザー出力と検出器ゲインを調整してください。

次に、光変換チャネルを有効にし、低レーザー出力を選択します。タイムラプスシリーズのイメージングを開始し、初期蛍光の顕著な退色が観察されるまで、光変換レーザーを徐々に強めます。初期蛍光が約75%退色するまでスキャンを継続します。

次に、光変換チャネルを不活性化し、光変換された蛍光を検出するための検出チャネルを活性化します。低いレーザー出力で、検出器ゲインを高く設定してイメージングを開始します。その後、光変換された蛍光が検出されるまで、徐々にレーザー出力を上げていきます。

検出後、最適な画像品質を得るために、レーザー出力またはゲインを調整します。最後に、光変換に使用するレーザー出力とその照射時間を最適化します。レーザー出力を上げると、光変換の速度が加速します。

しかしながら、レーザー出力が高すぎるとタンパク質が光退色します。最適な光変換効率、レーザー出力、および照射時間が決定すれば、これらのパラメータを使用して標準的な光退色モジュールまたは光退色後蛍光回復（FRAP）モジュールを構成できます。その後は、M orange twoのレッドシフトしたスペクトル特性により、光変換チャネルは不要になります。

デュアルプローブ光学ハイライティングには、緑色の光スイッチ可能蛍光タンパク質drawn PUと組み合わせて使用できます。デュアルプローブ光学ハイライティングを開始するには、まずHeLa細胞をガラスボトムMatTekディッシュで培養し、イメージングの24時間前に、標準的なLipofectamine 2000トランスフェクションを用いて、蛍光タンパク質をコードするプラスミドを細胞に導入します。

生細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡に設置し、前述のようにM orange twoの光変換に合わせて顕微鏡を設定します。次に、DPAの光スイッチング用に顕微鏡を構成します。DPAは488 nanometerの光で励起され、その蛍光はM orange two光変換チャンネルを用いてイメージングできます。

MPAのイメージングに使用するレーザー出力は、過剰な出力がMPAの不活性化を引き起こすため、最小限に抑えてください。800 nmの2光子励起を用いたMPA光活性化用のチャンネルを追加します。その後、光活性化およびOFA蛍光の光不活性化のイメージングに必要なレーザー出力を決定してください。

本手順において最も困難な点の一つは、M orangeを光変換させることなくRPAを不活化させることです。なぜなら、これら両方の現象が同じ波長で起こるためです。これを防ぐためには、光変換を慎重に最適化することが非常に重要です。

レーザー出力と照射時間について。mOrange2の光変換とPUの不活性化は、ともに488 nmの光励起によって起こるため、注意が必要です。mOrange2の著しい光変換を避けつつPUを不活性化させるには、条件を調整してください。mOrange2の光変換およびDPAの光スイッチングのパラメータが設定された後は、より低いレーザー出力を使用してください。

デュアルプローブ光学的ハイライティングが可能です。まず、低出力の488 nanometer励起を用いて、視野全体のDPA蛍光を不活性化させます。次に、関心領域を選択し、高出力の488 nanometer励起でm orange twoを変換します。

最後に、関心領域を選択し、800 nmの二光子励起を用いてDPA蛍光を活性化させます。蛍光タンパク質液滴サンプルは、共焦点顕微鏡による光変換アプリケーションのセットアップに最適です。液滴サンプルが正しく調製されていれば、液滴は非常に均質に現れます。

しかし、顕微鏡スライドガラスにカバーガラスを被せずにサンプルを調製すると、調製したサンプルにおいて液滴がガラス表面の一方に押し潰される傾向があります。0.1% BSAが存在しない場合、蛍光タンパク質は一つの油水界面に蓄積する傾向があります。蛍光光変換のハローを形成させるには、レーザー強度と照射時間が極めて重要となります。

レーザー出力が強すぎたり、露光時間が長すぎたりすると、光退色が起こり、光変換後の赤色蛍光が減少します。M orange 2とPHOの明確なスペクトル特性により、光変換前に2種類のプローブで光学的なハイライトを行うことが可能です。M orange 2、ヒストンH2B、およびDPA mitoを発現している細胞では、核にオレンジ色の蛍光が、ミトコンドリアに緑色の蛍光が認められます。低出力の488 nm励起で全ての蛍光をオフにした場合、M orangeの光変換は最小限に抑えられます。

M orange twoは、高出力の488 nanometer励起によって赤色へ光変換させることができます。M orange twoが光変換されると、800 nanometerの二光子励起を用いて、再び蛍光をオンに切り替えることが可能です。このデュアルプローブ光学ハイライティングにより、細胞を4つの異なる方法で標識することができます。

この手法を用いることで、4つの異なる細胞集団を特異的に標識することが可能です。これまで見てきたように、この手順で最も困難な点の一つは、m orangeを光変換させることなくMPAを不活性化させることです。この操作を習得すれば、例えば膵β細胞における複数の集団のトラッキングなど、本システムを用いたさらなる実験を行うことができます。

以上となります。このプレゼンテーションがお役に立てば幸いです。皆様の実験の成功をお祈りしております。