イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング
June 16th, 2010
刺激誘発の[Ca 2 +] iの信号が評価されています。運動性の細胞は、カルシウムがロードされています 2 +感受性蛍光色素（AM -エステル法）とperfusableチャンバー内に固定化した。細胞は、タイムラプス蛍光顕微鏡で画像化し、灌流媒体を介して刺激されています。単一細胞（または地域）の応答は、Excelを使用してオフラインで分析されています。
この手順の全体的な目標は、蛍光カルシウムレポーターダイで標識された固定化されたヒト精子から画像シリーズを取得することです。モチル細胞は、インキュベーション培地に泳いで入ることにより、精漿から単離されます。容量化後、細胞を蛍光カルシウムインジケーターで標識し、倒立蛍光顕微鏡に取り付けた可融イメージングチャンバーに移します。
カルシウムイオン濃度応答をタイムラプス画像シリーズとして取得し、解析してシングルセル応答を抽出します。こんにちは、英国バーミンガム大学バイオサイエンス学部のDr.Steven J.Public Cova研究室のEdwin Andres Morales Garciaです。私はキャサリン・ナッシュ、同じくPublic Overlapの出身です。
そして、パブリック・オーバーラップのジェニファー・モリスです。今日は、個々のヒトペラート土壌における細胞内カルシウム応答をイメージングする手順を示します。私たちの研究室では、この手順を用いて、卵子と雌のトラップから得られる刺激を用いた精子活動の制御
を研究しています。それでは始めましょう。精液サンプルを採取の瞬間から摂氏37度で30分以内保存し、精液血漿PETからモーター細胞を分離します 0.3%BSA(S-E-B-S-Sと略される)を添加したL'Sバランス塩溶液1ミリリットルを一連の5ミリリットルポリスチレン丸底チューブに。各チューブにS-E-B-S-Sを0.3ミリリットルの精液で優しく敷き詰め、チューブをゆるくキャップします。
チューブを45度の角度で1時間、摂氏37度、二酸化炭素6%でインキュベートします。運動性細胞がS-E-B-S-Sに泳ぎ上がるように、溶液の上部0.7ミリリットルをそっとピップし、すべてのチューブから溶液をきれいな15ミリリットルのポリスチレン遠心チューブに引き込みます。ホルマリンで固定化されたカウント細胞を新しい腸計数室で混合するために、穏やかに振とうします。
S-E-B-S-Sで1ミリリットルあたり600万個の細胞に濃度を合わせ、精子を5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブで200マイクロリットルのアリコートに分割します。ゆるくキャップをします。容量性細胞の応答が研究されている場合は、37°Cおよび6%二酸化炭素で5〜6時間チューブをインキュベートして容量化を可能にする 10マイクロリットルの10%ポリリジンを小さな滴の数として22×50ミリメートルの中心に適用します。
ナンバーワンはカバースリップで、完全に乾かします。真空グリースを使用して、カバースリップ処理面を上にして、構築された可溶イメージングチャンバーに取り付けます。目的のため。
イメージング実験ごとに、容量のある細胞のチューブを1本選択し、1.2マイクロリットル、2.5ミリグラム/ミリリットルを1ミリリットル加えます。カルシウム依存性臓器緑色をDMSOに溶解し、最終濃度10マイクロモル。チューブを摂氏37度、二酸化炭素6%で40分間インキュベートします。
200マイクロリットルのペプトとP 200チップを使用して、チューブからすべての溶液を完全に取り除きます。流入ポートに静かに注入してチャンバーを満たします。泡が流出物から逃げるようにチャンバーを傾けます。
チャンバー全体をインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素6%でさらに20分間インキュベートします。精子がポリDリジンに付着できるようにするため。チャンバーを倒立型蛍光顕微鏡に取り付け、灌流装置に接続します。
調製物を少なくとも10分間暗闇に置いて、灌流を一掃します。ルーズ細胞と細胞外細胞は、40倍または60倍の拡大で位相差をつけて死滅し、各細胞からの蛍光を別々に評価できる細胞間隔が十分な視野を選択します。細胞は適切に付着している必要がありますが、好ましくは明確なフレジャー活性を示す必要があります。
顕微鏡を緑色の蛍光チャンネルに切り替えます。露光時間は、鮮明な蛍光画像を撮影するために必要な最小限に抑えてください。IQソフトウェアの光退色を減らすため。
時系列画像取得をアクティブにします。0.1ヘルツで画像を取得し、ソフトウェア制御のシャッターを使用して照明を制限します。最初に3〜5分間の制御期間で記録し、生理食塩水のカルシウム濃度を操作し、灌流システムのヘッダーで生理食塩水を変更して薬物を塗布します。
各刺激がヘッダーに追加される時間に注意し、このプロトコルの書かれた部分に記載されているようにチャンバーへの到着時間を計算します。オフラインで画像を分析するには、描画ツールの1つを使用して、各細胞または細胞の一部の周りに関心領域またはROIの輪郭を描き、この領域に動員されたカルシウムが格納されているため、後精子頭部を概説します。スライダーバーでスクロールして、画像シリーズを確認します。
ROI内に完全に留まらない細胞、他の細胞と重なる細胞、または細胞死に特徴的な蛍光強度の急激な低下に続く大規模かつ急速な増加を示している細胞を特定して除去します。関数 analyze を使用して、各 ROI の時間蛍光強度系列を生成します。その後、データをエクスポートしてスプレッドシートシートで分析できます。
これらの画像は、3マイクロモルのプロゲステロンによる刺激中に得られた一連の画像です。下段は疑似カラーでコーティングされています。相対的な強度の変化をよりよく示すために、プロゲステロンはここでチャンバーに入りました。ここは。
これらの結果は、タイムラプス ビデオでアニメーション化されます。蛍光強度が急激に上昇し、その後ゆっくりと増加することが、細胞内カルシウムレベルに対応する変化を示していることに注目してください。これらのデータは、ここでは3つの細胞の後頭部の平均強度から定量化されます。
矢印でマークした時点で3マイクロモルのプロゲステロンが添加されました。破線は平均制御蛍光を示します。今日は、良質な細胞を分離し、カルシウム感受性色素をロードし、刺激に対する個々の細胞の反応をモニターする方法を紹介しました。
この手順を行うときは、可能な限り最高の細胞集団を使用し、写真の損傷を避けるために細胞の照明を最小限に抑え、見ている反応に最も適した色素を選択することを忘れないでください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この研究では、時間経過蛍光顕微鏡を使用して、個々のヒトの精子における刺激によって引き起こされるカルシウムイオン濃度シグナルを評価します。運動性の精子細胞は、カルシウム感受性の蛍光染料を用いて染色され、画像化と分析のために固定されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- カルシウムシグナリングは、精子の機能と受精において重要な役割を果たします。
- カルシウムダイナミクスを理解することで、精子の調節と活性に関する洞察が得られます。
- 蛍光染料は、細胞内カルシウムレベルの可視化に一般的に使用されます。
- 時間経過撮像により、動的な細胞応答の観察が可能になります。
研究目的
- 運動性のヒト精子を分離し、刺激に対するカルシウム応答を評価すること。
- 個々の精子細胞におけるカルシウムダイナミクスの画像化と分析のための方法を開発すること。
- 卵由来の刺激に対する精子の挙動の理解を深めること。
使用された方法
- スイムアップ技術を用いた精液プラズマからの運動性の精子の分離。
- カルシウム感受性の蛍光染料を用いた精子の染色。
- 精子の灌流可能な画像化チャンバー内での固定。
- カルシウムイオン濃度変化を捕捉するための時間経過蛍光顕微鏡。
主な結果
- 個々の精子細胞からカルシウム応答が正常に記録されました。
- プロゲステロンによる刺激は、蛍光強度の観測可能なスパイクをもたらしました。
- データ分析により、細胞内カルシウムレベルの有意な変化が明らかになりました。
- 結果は、明確性を高めるため、時間経過ビデオ形式で視覚化されました。
結論
- この方法は、ヒトの精子におけるカルシウムシグナリングを研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- カルシウムダイナミクスの理解は、生殖生物学と不妊症研究に情報を提供する可能性があります。
- 将来の研究では、異なる刺激とそれらの精子機能への影響を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Imaging intracellular calcium signaling in human sperm provides a functional readout for assessing sperm motility and fertilization potential, which are critical endpoints in male infertility diagnostics and contraceptive development. This method enables mechanistic de-risking of compounds targeting sperm-specific ion channels or signaling pathways by directly measuring physiological responses in a disease-relevant system. The approach supports target validation and assay development for reproductive health programs by delivering quantitative, single-cell data on stimulus-evoked calcium flux.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to sperm ion channel modulation and intracellular signaling pathways.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming functional target engagement in human sperm under capacitating conditions.
- Predictive Value: Generates dose-response data that inform lead identification and prioritization based on calcium flux modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, dye-loaded human sperm suspensions suitable for high-content fluorescence screening.
- Quantitative Output: Delivers time-lapse fluorescence intensity measurements that enable calculation of % change from baseline for comparative compound evaluation.
- Reproducibility: Standardized loading and perfusion protocols support consistent data generation across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human sperm as a direct translational model for studying mechanisms of infertility and contraceptive action.
- Mechanistic De-risking: Links compound exposure to functional calcium responses, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to physiological outcomes by measuring real-time signaling in motile, capacitated sperm.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for programs focused on reproductive tract targets where functional sperm assays are predictive of in vivo efficacy.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of sperm-specific targets by linking ligand exposure to intracellular calcium dynamics.
- Screening: Enables assay standardization through controlled dye loading, perfusion, and imaging conditions that support reproducible fluorescence readouts.
- Analytics: Provides single-cell, time-resolved calcium flux data that allow comparison of stimulation conditions and compound effects.
- Translational Research: Uses human sperm to maintain physiological relevance, supporting continuity from mechanistic insight to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing compound effects on sperm function across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by providing direct evidence of calcium signaling changes in human cells.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cell isolation, dye loading, and perfusion procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering functional data that reduce reliance on surrogate biomarkers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on demonstrated effects on sperm calcium signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sperm handling, fluorescence microscopy, and image analysis to ensure data quality.
- Dependent on perfusion systems and inverted microscopes capable of time-lapse acquisition with minimal phototoxicity.
- Necessitates standardization across teams for cell preparation, dye concentration, and stimulation timing to ensure comparability.
- Adaptation to other model systems may require optimization of adhesion conditions and dye loading protocols.
- Practical limitations include dye loading efficiency and photobleaching risks, which are mitigated by using visible wavelength dyes and controlled illumination.
