Name: イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ蛍光カルシウムイメージング法で個々のヒト精子のカルシウムシグナリングを可視化する技術。遊泳法で分離した精子を蛍光色素で標識し、タイムラプス顕微鏡で刺激応答を解析する方法を解説します。

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この作品は、ウェルカムトラスト、医学研究評議会、王立協会、バーミンガムサイエンスシティと不妊の研究の信頼によって資金を供給される。我々は、イメージングのリグを構築し、統合にケーン研究の専門家の支援に感謝します。

通常の精液検査と健康肥沃な男性からの精子は、通常、次のように画像処理のために準備されています。 <ol><li>精液サンプルは最大30分間37℃で保存されています。 1.8のCaCl 2 · 2H 2 O、5.37のKCl、0.81のMgSO 4 · 7H 2 O、26.2 NaHCO 3を 、1.0のNaH 2 PO 4：mMの、細胞が補充アールの平衡塩溶液（sEBSSにスイムアップによって精漿から分離されています。 2H 2 O、0.3％木炭de-lipidated/fatty酸フリーフラクションV BSA（BSAの品質は、精子の正常な受精能獲得のために重要である）を添加した116.4のNaCl、55.6 D -グルコース、2.73のNaピルビン酸、41.8のNa乳酸）。 sEBBS 1 mlを5 mlのチューブのシリーズのそれぞれにピペットでゆっくりと精液の0.3 mlをunderlayeredている。 1時間のインキュベーションの後（37℃、6％CO 2）上位0.7ミリリットルを静かに各チューブから除去し、プールされます。精子懸濁液10μlを、細胞を固定するために1％ホルマリン（v / v）を90μlで希釈され、その後、精子がノイバウアーチャンバ内にカウントされます。懸濁液中の細胞密度は、6万細胞/ mlに（sEBSS付き）調整されます。 </li><li>受精能獲得を可能にするために5-6時間で、（6％CO 2 37 ° C）試料は、その後緩やかに覆われた管とインキュベーションで200μlのアリコートに分割されています。 </li><li>カバースリップ（22x50 mm）は、以前にポリ- D -リジンで処理されています。ポリ- D -リジン溶液（10％w / v）の10μlを、カバースリップの中央に小さな液滴の数として適用されます。ポリ- D -リジンは、空気乾燥されている。これは、加熱されたステージ上に置くことができますし、乾燥を完了するはずです。 、perfusable、専用、密閉ポリカーボネートイメージング室（寸法35ミリメートル× 20ミリメートル× 5ミリメートル、≈180μlの容量）に真空グリースでカバーに取り付けられている。ワーナーRC20チャンバーに似てポリ- D -リジンは、コー​​ティングされたカバースリップは、細胞を倒立顕微鏡上で表示されているチャンバーの基盤を形成し、12 mm径の円形カバースリップは、光の透過を可能に、チャンバーの上面を形成している。 </li><li>オレゴングリーンBAPTA1 - AM（OGB）またはカルシウムグリーン1 - AMは、ラベルのセルに使用されます。 OGBはDMSOに溶解して調製する。プルロン酸F127は、（洗剤）染料の"凝集"を防止するためにDMSOに含まれています。これは、使用直前に、液（0.5mlのDMSO中100 mgのプルロニック）実験室で調製する​​ことができる、または事前に用意された購入することができます。 20μlのOGBの50μgのアリコート（2.5 mg / mlの）に追加されます。バイアルは、凍結し、後で使用するために解凍保存することができます。 </li><li>精子の受精能獲得後（sEBBSで5〜6時間、37℃、6％CO 2）チューブは、イメージングのために選択され、OGBソリューション1.2μlを添加し、10μMの最終濃度を与える。チューブは、その後、細胞懸濁液を静かにP1000（青）ピペットの先端を持つイメージングチャンバーの流入口に注入された後、さらに40分間インキュベートする。チャンバーは20分間、ダウンインキュベーター、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの側に配置されます。細胞はチャンバーの表面に沿って泳ぐこととポリ- D -リジンでコーティングされた領域に付着する傾向がある。 </li><li>チャンバーは今灌流装置に接続し、約0.5ml /分で灌流、顕微鏡にマウントされています。ローラーポンプ出口ポートからチャンバーとオーバフローに生理食塩水フィードは、トラップと吸引ポンプにより除去される。ルース細胞と細胞外色素がチャンバーの灌流によって削除されるしながら準備は、少なくとも10分間暗所に残されている。温度安定性は、小さな変動が唯一の細胞のCa 2 +恒常性に影響しないことがありますので、決定的に重要であるだけでなく、染料のK d に影響を与える可能性があります。実験は通常25で行われる℃で、このレベルでは暗い部屋の温度を維持することによって達成した。我々は、必要なレベルで室温を維持する温度制御ステージまたは生理食塩水流入でサーモスタット制御のヒーターを使用するよりも高い温度とフォーカスの安定性を提供することを見出した。 </li><li>細胞は、対照的に（油浸40倍または60倍）目標とイメージングのためのエリアが選択されている相の下に表示されています。入口ポートの近くにあるポリ- D -リシン被覆面積の部分は、生理食塩水の流れが層流と一致しているところ、好ましい。細胞密度が適切である領域を使用することも重要です（過度の密度は、隣接するセルからの信号のピックアップを介してデータの品質と整合性に影響を与える）と細胞が適切に接続されていますが鞭毛の活動が目に見えるです。位相コントラスト画像が保存されます。顕微鏡、蛍光モード（励起480nmの、発光540nmの）に切り替えられると、露光時間は明確な蛍光画像を（通常は50から200ミリ秒）を取得するために必要な最小限に抑えています。 </li><li>実験は、時系列画像収集ソフトウエア（IQ）を活性化することによって開始されます。一般的に画像は、0.1 Hzで取得され、照明は、ソフト制を用いて画像取得の期間に限定されています制御シャッターを再。はるかに大きい画像取得レートを使用することができますが、引当金は、漂白し、細胞への光損傷に起因するアーチファクトの世代の問題（説明を参照）ごとに行う必要があります。 IQは（そして他のほとんどの買収のソフトウェアプラットフォーム）実験中に蛍光のリアルタイムのグラフ化が可能になります。 </li><li> 3-5分の持続時間の生理食塩水の成分の操作（そのような[Ca 2 +]のOなど）と薬物のアプリケーションの制御周期後に灌流ヘッダー内の生理食塩水の置換によって達成される。各刺激の加算の時間が記載されているので、撮影室に到着のその時は、ここで説明する、レスポンスが遅い（0.1 Hzでサンプリング）の評価のための十分な精度を提供する、計算することができます。より迅速な応答では高い精度は、ワーナーRC20室に設けられた第2流入ポートを介して生理食塩水の流れに直接刺激を加えることによって達成することができます。 </li><li>画像は、IQを使用してオフラインで分析されています。興味（ROIを）の領域は、各セルの周りに描かれている（または細胞の一部）と、セルの空き領域は、ソフトウェアによる自動バックグラウンド除去のために（選択されています。画像のシリーズは、先体反応を停止したか、受けた細胞を除去するためにチェックされている（その実験中）細胞質色素の損失が続く蛍光の大規模かつ急速な増加として表示され、時系列として解析するときにアーティファクトを引き起こすのに十分な動きを示したもの。 </li><li>時間の蛍光強度のシリーズは、各ROIのために取得され、これらのデータは、Excelでオフラインで分析されています。最初は蛍光は、式を使用して、制御期間中に得られた平均値に正規化されてR = [（FFの残り ）/ F 残り ] × 100％は、Rは制御周期に比べて蛍光の％の変化であるときは、F蛍光強度である時刻tとFの残りの部分は、制御期間中に得られたFの少なくとも30測定の平均です。 </li></ol>代表的な結果図1は、細胞を3μMのプロゲステロンで刺激した実験からの一連の画像を示しています。上段と映画1はグレースケールの蛍光画像と同じ魔術を示す（表の'16_colorsルックアップ擬似カラーで（と映画では2）を以下に示す"イメージJに）、ここで、"クール"色が低い蛍光強度を示し、 "暖かい"色が高い蛍光強度を示している。細胞は、IQのルックアップテーブルを用いて、実験中に擬似カラーで表示できますが、グレースケールを使用すると、一般的に評価するためのより有益です。細胞はよく標識かどうかをすることができます。最初の二つの画像は、0秒と100秒の録音を開始した後に採取した。蛍光が安定しており、後の先体領域と精子の首で最強になる傾向があります。プロゲステロンは、約175秒で撮影室に入り、3番目と4 番目の画像（180秒および220 s）は[Ca 2 +] iの（蛍光）セルの後部頭頸部領域に起因するの急速な増加を示しています。その後の画像は、初期の減衰を示し、290、360、740、990から1440秒にあり[Ca 2 +] iの一過性と二次持続的上昇の開発。図2は、正規化された蛍光の各ROI（制御周期に比べて蛍光の％の変化）のために生の蛍光値を変換し、スプレッドシートの分析を示す図3は、3μMのプロゲステロンに"典型的な"応答を示す3個の細胞のための時間正規化蛍光のプロットを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="図1"> プロゲステロンで刺激した細胞から図1の例のデータ。グレースケール（上段）と擬似カラー（下段）の蛍光画像のシリーズが表示されます。タイムポイントは0、180、220、290、360、990sです。 3μMのプロゲステロンは175秒で撮影室に入りましたROIは最初のパネルに表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="図2"> 図2 Excelでの単一細胞の蛍光のデータの分析。黒内の数値は、垂直に配置された蛍光データの時系列です。赤色の数字は（下）テキストで与えられた式を用いて得られる正規化されたデータです。グラフには、刺激により、小さな振動の遅い立ち上がりと続く一連の蛍光の一過性上昇を示し、この実験ではセル64の正規化蛍光リアルタイムプロットを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="図3"> 値を制御する点で％の変化として表現される3個々のセルについては、 図3。蛍光リアルタイムトレース、.. 3μMのプロゲステロンは、矢印でマークされた時に追加されました。破線で示すには、コントロールの蛍光を意味する。

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

正常に実行する場合は、この手法により、ヒトの精子における自発的および誘導のCa 2 +シグナルの分布と動態の記録。レスポンスは、人間の精子が自分の自発的な刺激のCa 2 +シグナルの変動の多くを示すことができるので重要である細胞（最大200）の多数から得ることができる。成功したラベルと記録中の細胞の生存は、サンプルの品質に大きく依存しています。悪いサンプルは貧しいラベル付け、不良反応と細胞が録音中に死ぬ可能性を与える。 ヒト精子の写真損傷に非常に敏感であり、それゆえ我々は細胞の生存を最大化し、細胞死に起因するアーチファクトを最小限に抑えるために最低限必要な照度を（強度と露光時間の両方）を使用します。高感度カメラは、（低輝度照明の使用を許可する）カメラが弱い蛍光をピックアップするので大きなメリットです。裏面照射型、EM - CCDカメラは、非常に高価なのに、特に適しています。代わりに、励起フィルターとキセノンや水銀ランプを使用してのLED照明は、（また、細胞の生存（西垣ら、2006）が向上します。 フラは、UV光で励起する必要があるため、それがそれぞれの比率の2つの画像を撮影する必要があるので、私たちは、レシオメトリックイメージングの明白な利点にもかかわらず、フラ-2を使用しないでください。単一波長、可視光の染料、蛍光強度の正規化で得られたデータについては、主に細胞間の色素ローディングの違いのためではなく、個々のセル内の色素分布を補正し、これは留意する必要があります。単一波長の色素は、原則として、キャリブレーションすることができますが、技術の精度が悪く、我々はこれを行うにはしないでください。 さらにキャリブレーションなしフラ-2（または放出比染料インド）、、で得られた比のデータが[Ca 2 +] iの相対的な変化の許容忠実な表現を与えるのに対し、単一波長の色素の蛍光強度が直線的にはほど遠いです。の[Ca 2 +] iに関連して飽和曲線の最も有用な部分を介して単一波長の色素の関係は、通常、対数に近似している。我々は現在使用オレゴングリーンBAPTA - 1（図4）それは小さな変化に敏感であるための[Ca 2 +] iは近いレベルの（50 nM）を休憩する。するときの[Ca 2 +] iは1μMの応答は蛍光変化の観点から過少表現され、染料が飽和する可能性を超えて上昇。 UV励起に頼ることなく、技術の向上のためのオプションは、このようにみたFluo - 3、フラ赤などの染料でロードセルを2倍にすること。両方は、488 nmで励起が同時に彼らの反応は非常に異なっていることができます。 540と650 nmでの発光の記録は、[+のCa 2] iの（Haughland、2002）と精子（Nisigakiら、2006）に適用される可能性があるの正確なモニタリングのためのより良い方法を提供することができます比を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="図4"> 図4。オレゴングリーンBAPTA - 1およびオレゴングリーンBAPTA - 2用のフリーの[Ca 2 +]（nM）およびピーク波長（約525nmの）での蛍光発光との関係。 OGB1は〔Ca 2 +]が、より低いレベルで飽和し、その結果、より小さい使用可能な範囲を持って休んでより高い蛍光を示します。これらのプロットのデータは、Molecular Probes社ハンドブック（Haughland、2002）から得た。

<table><tbody><tr><td>低照度カメラ</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>パブリックドメインソフトウェア</td></tr><tr><td>LED照明システム</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (DMSOによる20%溶液)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

蛍光灯、Caでロードされた細胞の蛍光顕微鏡<sup&gt; 2 +</sup&gt;感受性色素Caの空間的および時間的な側面の測定に使用されます<sup&gt; 2 +</sup&gt;生細胞のシグナル。ここではCaでヒト精子の懸濁液をロードするための我々の研究室で使用される方法を説明します<sup&gt; 2 +</sup&gt; - 報告染料をして生理的刺激時の蛍光シグナルを測定する。運動性の細胞は、直接スイムアップで単離し、実験に応じて、0〜24時間capacitating条件下でインキュベートする。 Caの細胞透過性のAM（アセトキシメチルエステル）エステルの形<sup&gt; 2 +</sup&gt;報告の染料は、hが細胞質中に色素をロードするために許可されている細胞のアリコートと1の期間に追加されます。我々は、細胞への光ダメージを最小限に抑えるために、可視波長色素を使用していますが、これはレシオメトリック録音が可能ではないことを意味します。このアプローチの利点と欠点について説明されています。ロード期間の細胞中にイメージングチャンバーに導入し、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップに付着させています。ロード期間の過剰の染料とバラセルの終了時に灌流装置にチャンバーの接続が削除されます。室が継続的に灌流され、刺激と変更されたSalinesのは、その後灌流ヘッダーに追加されます。実験は、蛍光画像の経時的買収によって記録され、手動で関心領域を描くことで、詳細をオフラインで分析されます。データは、各セル（またはセルの一部）、Caを示すグラフについては、そのような前刺激のレベルに正規化されています<sup&gt; 2 +</sup蛍光の％の変化に応じて&gt;応答が得られる。

刺激誘発の[Ca<sup&gt; 2 +</sup個々の人間の精子の&gt;] iの信号が評価されています。運動性の細胞は、カルシウムがロードされています<sup&gt; 2 +</sup&gt;感受性蛍光色素（AM -エステル法）とperfusableチャンバー内に固定化した。細胞は、タイムラプス蛍光顕微鏡で画像化し、灌流媒体を介して刺激されています。単一細胞（または地域）の応答は、Excelを使用してオフラインで分析されています。

蛍光Ca2+感受性色素を導入した細胞の蛍光顕微鏡観察は、...におけるCa2+シグナリングの空間的および時間的側面の測定に用いられる。

この手順の全体的な目的は、蛍光カルシウムレポーター色素でラベルした固定ヒト精子から画像シリーズを取得することです。まず、精液プラズマから遊泳能のある細胞を培養液中へ泳ぎ上がらせることで単離します。キャパシテーション後、細胞を蛍光カルシウムインジケーターでラベルし、倒立蛍光顕微鏡に搭載された密閉可能なイメージングチャンバーへと移送します。カルシウムイオン濃度の応答をタイムラプス画像シリーズとして撮影し、解析することで単一細胞の応答を抽出します。こんにちは、私はバーミンガム大学（英国）バイオサイエンス学部、Steven J. Public Cova博士の研究室のEdwin Andres Morales Garciaです。そして、同じくPublic OverlapのKatherine Nashです。私はPublic OverlapのJennifer Morrisです。本日は、個々のヒト精子における細胞内カルシウム応答をイメージングする手順をご紹介します。当研究室では、卵子や女性生殖道由来の刺激を用いた精子活性の調節を研究するために、この手法を用いています。それでは始めましょう。精漿から運動精子を分離するため、採取後30分以内に精液サンプルを37°Cで保存します。0.3% BSAを添加したL'Sバランス塩溶液（略称：S-EBSS）1 mLを、一連の5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブに分注します。各チューブのS-EBSSの上に、精液0.3 mLを静かに重層させ、チューブのキャップを緩く締めます。チューブを45度の角度に傾け、37°C、6% carbon dioxideの条件下で1時間インキュベートします。運動能のある細胞がS-E-B-S-S内へ泳ぎ上がるようにするため、上層の0.7 milliliterの溶液をピペットで静かに除去し、すべてのチューブの溶液を清潔な15 milliliterポリスチレン製遠心チューブに回収します。軽く振って混合し、formalinで固定した細胞を新しいボーエル血球計数器を用いてカウントします。S-E-B-S-S中での細胞濃度を6 million cells/mLに調整し、精子を200 µLずつ5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブに分注します。キャップを緩く閉めます。キャパシテーションした細胞の反応を調べる場合は、チューブを37 °C、6% CO2条件下で5〜6時間インキュベートし、キャパシテーションを誘導します。22 × 50 mmのカバーガラスの中央に、10% polylysineを10 µL、少量ずつ数滴滴下します。カバーガラスの1面を処理し、完全に乾燥させます。真空グリースを使用して、処理した面を上に向けた状態で、その目的のために構築された融合イメージングチャンバーに取り付けます。各イメージング実験において、キャパシテーション済みの細胞が入ったチューブを1本選び、最終濃度が10 µMとなるように、DMSOに溶解した2.5 mg/mLのCalcium dependent organ greenを1.2 µL添加します。チューブを37 °C、6% CO2条件下で40分間インキュベートします。P 200チップを装着した200 µLピペットを用いて、チューブ内の溶液を完全に除去します。流入ポートから緩やかに注入してチャンバーを満たします。チャンバーを傾け、気泡を流出ポートから脱気させます。チャンバー全体をインキュベーターに入れ、37 °C、6% carbon dioxideでさらに20分間インキュベートします。これにより、精子がpoly D lysineに接着するようにします。チャンバーを倒立蛍光顕微鏡に設置し、灌流装置に接続します。灌流によって不要なものが洗い流されるよう、試料を少なくとも10分間暗所に置きます。位相差顕微鏡を用いて40倍または60倍の倍率で、遊離細胞や細胞外領域を確認し、各細胞の蛍光を個別に評価できるよう、細胞間隔が十分な視野を選択します。細胞が適切に接着しており、かつ明確なfledge活性を示していることが望ましいです。顕微鏡を緑色蛍光チャンネルに切り替えます。鮮明な蛍光像を得るために必要な最小限の露光時間に設定してください。これはIQソフトウェアにおける光退色を軽減するためです。タイムシリーズ画像取得を有効にします。0.1 Hzで画像を撮影し、ソフトウェア制御のシャッターを使用して照明を制限します。まず3〜5分間のコントロール期間として記録を行い、その後、灌流システムのヘッダーで生理食塩水を交換することにより、生理食塩水のカルシウム濃度を操作し、薬剤を投与します。各刺激をヘッダーに追加した時間を記録し、本プロトコルの記述部分に従ってチャンバーへの到達時間を算出します。オフラインで画像を解析する場合、描画ツールのいずれかを使用して、各細胞または細胞の一部にROI（関心領域）を設定します。ここでは、カルシウムが蓄積し動員される領域である精子の後頭部を囲みます。スライダーバーでスクロールして画像シリーズを確認してください。ROIから完全に外れた細胞、他の細胞と重なっている細胞、または細胞死に特徴的な蛍光強度の急激な上昇とその後の急落を示した細胞を特定し、除外してください。解析関数を使用して、各ROIの時間的な蛍光強度系列を生成します。その後、データをエクスポートし、スプレッドシートで解析することが可能です。これらの画像は、3 µMのプロゲステロンによる刺激中に得られた一連の画像です。下の行には擬似カラーが適用されています。相対的な強度の変化をより明確に示すため、プロゲステロンをここに導入しました。これらの結果はタイムラプスビデオでアニメーション化されています。蛍光強度の急速なスパイクに続いて緩やかな上昇が見られ、これは細胞内カルシウム濃度の相応の変化を示しています。これらのデータは、3つの細胞の頭部後方の平均強度から定量化されています。矢印で示したタイミングで3 µMのプロゲステロンを添加しました。破線はコントロールの平均蛍光強度を示しています。本動画では、高品質な細胞の単離方法、カルシウム感受性色素のロード方法、および刺激に対する個々の細胞の応答のモニタリング方法について解説しました。この手順を行う際は、可能な限り最適な細胞集団を使用すること、また光損傷を避けるために細胞への照射を最小限に抑え、目的とする応答に最も適した染料を選択することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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