イメージングカルシウムのためのテクニック ^{2 +}人間の精子でシグナリング

この手順の全体的な目的は、蛍光カルシウムレポーター色素でラベルした固定ヒト精子から画像シリーズを取得することです。まず、精液プラズマから遊泳能のある細胞を培養液中へ泳ぎ上がらせることで単離します。キャパシテーション後、細胞を蛍光カルシウムインジケーターでラベルし、倒立蛍光顕微鏡に搭載された密閉可能なイメージングチャンバーへと移送します。

カルシウムイオン濃度の応答をタイムラプス画像シリーズとして撮影し、解析することで単一細胞の応答を抽出します。こんにちは、私はバーミンガム大学（英国）バイオサイエンス学部、Steven J. Public Cova博士の研究室のEdwin Andres Morales Garciaです。そして、同じくPublic OverlapのKatherine Nashです。

私はPublic OverlapのJennifer Morrisです。本日は、個々のヒト精子における細胞内カルシウム応答をイメージングする手順をご紹介します。当研究室では、卵子や女性生殖道由来の刺激を用いた精子活性の調節を研究するために、この手法を用いています。

それでは始めましょう。精漿から運動精子を分離するため、採取後30分以内に精液サンプルを37°Cで保存します。0.3% BSAを添加したL'Sバランス塩溶液（略称：S-EBSS）1 mLを、一連の5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブに分注します。各チューブのS-EBSSの上に、精液0.3 mLを静かに重層させ、チューブのキャップを緩く締めます。

チューブを45度の角度に傾け、37°C、6% carbon dioxideの条件下で1時間インキュベートします。運動能のある細胞がS-E-B-S-S内へ泳ぎ上がるようにするため、上層の0.7 milliliterの溶液をピペットで静かに除去し、すべてのチューブの溶液を清潔な15 milliliterポリスチレン製遠心チューブに回収します。軽く振って混合し、formalinで固定した細胞を新しいボーエル血球計数器を用いてカウントします。

S-E-B-S-S中での細胞濃度を6 million cells/mLに調整し、精子を200 µLずつ5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブに分注します。キャップを緩く閉めます。キャパシテーションした細胞の反応を調べる場合は、チューブを37 °C、6% CO2条件下で5〜6時間インキュベートし、キャパシテーションを誘導します。22 × 50 mmのカバーガラスの中央に、10% polylysineを10 µL、少量ずつ数滴滴下します。

カバーガラスの1面を処理し、完全に乾燥させます。真空グリースを使用して、処理した面を上に向けた状態で、その目的のために構築された融合イメージングチャンバーに取り付けます。

各イメージング実験において、キャパシテーション済みの細胞が入ったチューブを1本選び、最終濃度が10 µMとなるように、DMSOに溶解した2.5 mg/mLのCalcium dependent organ greenを1.2 µL添加します。チューブを37 °C、6% CO2条件下で40分間インキュベートします。

P 200チップを装着した200 µLピペットを用いて、チューブ内の溶液を完全に除去します。流入ポートから緩やかに注入してチャンバーを満たします。チャンバーを傾け、気泡を流出ポートから脱気させます。

チャンバー全体をインキュベーターに入れ、37 °C、6% carbon dioxideでさらに20分間インキュベートします。これにより、精子がpoly D lysineに接着するようにします。チャンバーを倒立蛍光顕微鏡に設置し、灌流装置に接続します。

灌流によって不要なものが洗い流されるよう、試料を少なくとも10分間暗所に置きます。位相差顕微鏡を用いて40倍または60倍の倍率で、遊離細胞や細胞外領域を確認し、各細胞の蛍光を個別に評価できるよう、細胞間隔が十分な視野を選択します。細胞が適切に接着しており、かつ明確なfledge活性を示していることが望ましいです。

顕微鏡を緑色蛍光チャンネルに切り替えます。鮮明な蛍光像を得るために必要な最小限の露光時間に設定してください。これはIQソフトウェアにおける光退色を軽減するためです。

タイムシリーズ画像取得を有効にします。0.1 Hzで画像を撮影し、ソフトウェア制御のシャッターを使用して照明を制限します。まず3〜5分間のコントロール期間として記録を行い、その後、灌流システムのヘッダーで生理食塩水を交換することにより、生理食塩水のカルシウム濃度を操作し、薬剤を投与します。

各刺激をヘッダーに追加した時間を記録し、本プロトコルの記述部分に従ってチャンバーへの到達時間を算出します。オフラインで画像を解析する場合、描画ツールのいずれかを使用して、各細胞または細胞の一部にROI（関心領域）を設定します。ここでは、カルシウムが蓄積し動員される領域である精子の後頭部を囲みます。スライダーバーでスクロールして画像シリーズを確認してください。

ROIから完全に外れた細胞、他の細胞と重なっている細胞、または細胞死に特徴的な蛍光強度の急激な上昇とその後の急落を示した細胞を特定し、除外してください。解析関数を使用して、各ROIの時間的な蛍光強度系列を生成します。その後、データをエクスポートし、スプレッドシートで解析することが可能です。

これらの画像は、3 µMのプロゲステロンによる刺激中に得られた一連の画像です。下の行には擬似カラーが適用されています。相対的な強度の変化をより明確に示すため、プロゲステロンをここに導入しました。

これらの結果はタイムラプスビデオでアニメーション化されています。蛍光強度の急速なスパイクに続いて緩やかな上昇が見られ、これは細胞内カルシウム濃度の相応の変化を示しています。これらのデータは、3つの細胞の頭部後方の平均強度から定量化されています。

矢印で示したタイミングで3 µMのプロゲステロンを添加しました。破線はコントロールの平均蛍光強度を示しています。本動画では、高品質な細胞の単離方法、カルシウム感受性色素のロード方法、および刺激に対する個々の細胞の応答のモニタリング方法について解説しました。

この手順を行う際は、可能な限り最適な細胞集団を使用すること、また光損傷を避けるために細胞への照射を最小限に抑え、目的とする応答に最も適した染料を選択することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。