後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養
2007年5月28日
このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。
私の名前はダイアナ・ダウドで、ここカリフォルニア大学アーバイン校の解剖学および神経生物学、発生および細胞生物学の教授です。今日は、ショウジョウバエの蛹からのニューロン培養の準備についてお話しします。これには、後期の蛹から脳を摘出することが含まれ、通常は脳の中枢領域のみを培養します。
そしてこの段階では、成体の脳に存在する主要な解剖学的構造はすでに形成されています。これには、軸索をキノコ体領域まで送る投影ニューロンがあるアンテナローブと、アルファ、ベータ、ガンマローブを介して軸索を標的ニューロンに送ったキノコ体ニューロンであるケニア細胞が含まれます。培養当日、最初に行うことは、層流フードに入り、組織を解離するために使用する酵素溶液である無菌製剤を準備することです。
また、細胞を成長させるために使用する培地も作ります。そして、これは私たちが事前に準備した茎から作られています。次のステップは、この解離または解剖に使用する蛹を収集することです。
そして、これらは酵母や他のあらゆる種類のものが入ったバイアルで育てられるため、それはボンネットの外で行われます。そして、私たちは実際に解剖の初期段階をボンネットの外で行います。これは、小瓶の側面から取り除いたばかりののぞき見で、この左側の列には赤い目をした動物がいて、培養に適した段階です。
こっちのPPPは少し若く、こっちのPPPは少し若いです。彼らはオレンジ色または黄色の目をしており、これは大丈夫な1 0 7ラインです。彼らは、これらの段階での色が少し茶色になる通常の野生型よりもわずかに明るい目をしています。
これらの段階はすべて、文化、人々の脳文化を作るのに適しています。さて、ここでの最初のステップは、私が引き出してペトリ皿に並べた蛹のすぐ隣に解剖液を数滴垂らすことです。35ミリのシャーレの蓋を使用しています。
次に、左手にNo.5の鉗子を1対、最後に27ゲージの針が付いたCCツベルクリン注射器を1本取ります。これらは私の2つの解剖ツールです。そして、瞳孔ケースまたは蛹から頭を取り除くには、基本的にiを使用する必要があり、左手で鉗子で蛹を保持し、次に右手の針を使用して瞳孔ケースの前面を取り外します。
次に、キューティクルカバーをプルバックすると、頭が前面に飛び出します。次に、針を使って首の部分のIを切断し、頭を拾い上げて解剖生理食塩水の滴に入れます。この手順を10〜15回繰り返すのは、良い培養のために、各遺伝子型の動物を10〜15匹飼うのが好きだからです。
よし、動物の頭から脳を取り除いてみるよ。そのために、27ゲージの針を持つ2本のツベルクリン注射器を使用します。左の針を動物の股関節に通して、頭をペトリ皿の底に固定します。
そして、右の針を使って右側にスリットを開け、そこで脳を押し出します。さて、次のステップは、左の針を左目に置くことです。そして今、私は実際にex pushするだけで、脳はスリットを通して右側に出てくるはずです。
ほらそれが着きましたよ。右側に見えますが、今では右の針を使って、ヘッドカプセルの残りの部分や目から分離することができます。大丈夫です。さて、視葉の除去である最終的な解剖を行う前に、脳をきれいな生理食塩水に移します。
私はそれを行うためにパイプエマンを使用することができ、私は20マイクロリットルのパイプエマンのまさに先端でそれを拾い上げ、私はそれを5マイクロリットルに設定して使用するか、または私は実際に針にそれを転写することができます。これは、解剖手順の最後の段階です。それは新鮮な生理食塩水で行われ、通常、ここには約10〜15個の脳があります。
次に、27ゲージの針を切削工具として使用して、各脳の視葉を切断し、左の視葉を切断し、次に各脳の右の視葉を切断します。そしてこの時点で、この方法で処理されたすべての脳は、酵素溶液が入ったチューブに移され、酵素解離に使用されます。単一の遺伝子型からのすべての脳は、酵素溶液の1ミルを含む単一のエピスクリューキャップエイノチューブに入れられます。
そして、それらを試験管ホルダーに貼り付け、ローテーターに載せて室温で10〜15分間放置します。そして、それが解離の実際の時間です。酵素解離ステップを完了するには、実際に酵素を除去する必要があります。
そこで、チューブをEOR遠心分離機に持ち込み、チューブを遠心分離機に入れ、3000RPMで3分間回転させます。脳を回転させた後、今度は脳を層流フードに運びます。ここから、手順の滅菌部分が始まります。
ここでは、層流フードの中にいる場合を除き、チューブを開かず、酵素溶液を取り出します。それを解剖液に置き換え、その後、解剖液で何度も回転して洗浄し、最終的に細胞を成長させるための定義された培地にたどり着きます。大丈夫です。
ここで最初に行う必要があるのは、これらのシャーレにあるカバースリップのそれぞれに5マイクロリットルの生理食塩水の滴を置く必要があるということです。ペトリ皿ごとに1枚のカバースリップがあり、コンラミニンでコーティングされているので、カバースリップの真ん中に5マイクロリットルのドロップを入れました。そこに私のラミニンの滴があります。
それは非常に重要な原因です あなたはフィールドの真ん中にあなたの細胞を集中させたいので、私たちは脳あたり約10、000の細胞を取得し、それが私たちが単一の培養を作るものです。さて、顕微鏡で見てみると、すでに酵素解離の手順を経た9つの脳があります。まだほとんど無傷であることがわかります。
彼らは視神経ローブを持っていません。それらは取り除かれましたが、脳の中枢領域だけがあり、今度は1つの脳をピペットでつなぎ、カバースリップの5マイクロリットルの滴に移します。そして、それを4回繰り返します。
27ゲージの針に1CC注射器を2本取ります。繰り返しになりますが、これらは非常に安価で使い捨ての解剖ツールであるため、学部生は予算を気にせずにこれを行うことができることに注意することが非常に重要です。さて、これで2本の針が手に入り、最初の機械的な解離を行いますが、これはこの脳をいくつかの断片に切断することで、実際にこれらの断片をガラスピペットに吸い込み、最終的な解離を完了するためのわずか1分で完了させるものです。
これをやっているときは、小さな断片にするのではなく、全体のサイズを小さくして、ピペットが少しだけ得られるようにしたいのですが、解離を行うときに、全脳よりもわずかに小さな断片が浮かび上がってくるようにします。また、メディアのドロップが小さいことがわかるので、比較的早くやりたいと思っています。つまり、表面と体積の比率が高く、溶液を長時間放置すると、溶液のpHと浸透圧の両方が変化する可能性があります。
私が最初にこれをやったとき、実際には一度に2つの脳、一度に2つの文化しかやらなかった。今は普通に4回やるんだけど、これからピペットを壊すんだけど、それについて話すことも何もできないよね?これはちょうど終わったところです。
解離、ピペットのサイズはかなり良かったです。私は組織を上下に数回吸い込むことができました、そしてあなたは個々の細胞を見ることができます、そしてそれらはまだ塊を持っています、しかしそれは大丈夫です。彼らは洗い流されます。
現在、培養物は、めっきされるとすぐに2番目のシャーレに入れられ、数分以内にCO2インキュベーターに入れられます。これは、pHと浸透圧を生存をサポートするレベルに維持したいからです。だから、皿を氾濫させる前に、ここに30分間それらを突き刺します。これらの培養物は、後期の蛹の脳から調製されました。
培養物はCO2インキュベーターで2日間培養され、プロセスが延長された個々の細胞を見ることができます。プロセスの精緻化の程度は、5 日後に見るものよりも小さく、1 日で見るものよりも大きくなります。私の名前はホルヘ・アノです。
私はDoubts研究室で働いています。これから、私たちが準備したばかりの人々の文化におけるカルシウムイメージング実験の実験をどのように行うかをお見せします。これは、カルシウムイメージング実験のビデオで、青色の細胞はカルシウム濃度が低いことを示し、赤色の細胞はカルシウム濃度が高いことを示しています。
赤に変わる細胞がいくつかあり、それは細胞内カルシウムレベルが増加していることを示しています。そして、それらは自然発生的なものもあれば、一時的なものもあります。彼らは時間の経過とともにバールのカルシウムレベルに戻り、しばらくすると、薬、この場合はニコチンを適用し、細胞が細胞内のカルシウムレベルを上昇させるのがわかります。
ニコチンを100秒間適用し、その後ニコチンに注意すると、細胞は基礎カルシウムレベルに戻ります。ですから、この培養システムの本当の利点は、ハエのトランスジェニック系統と突然変異系統の両方から培養物を作ることができること、つまり、ニューロンの異なる亜集団がGFPで標識されている異なる系統を作ることです。これは、私たちが使用した系統の1つで、GFPがキノコの体、ケニアの細胞、学習や記憶などの複雑な行動の媒介に関与するニューロンで発現している脳です。
細胞体は、赤い矢印がある領域の周りの脳の背側にあります。そして、GFP陽性のこれらのL字型構造は、実際にはこれらのキノコ体ケニアの細胞からの軸索突起です。この脳組織の解離後。
ニューロンは培養中でそのプロセスを再生し、この場合、GFP陽性のケニアの細胞を簡単に特定できます。これらは、当時の標準的な電気生理学的記録とカルシウムイメージング研究の両方にアクセスできます。したがって、これらの培養物は、成体動物の複雑な行動を媒介する上で重要であることがわかっているニューロンの機能を制御する上で重要な遺伝的および環境的要因を調査するための非常に有用なツールです。
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概要
このビデオは、後期のショウジョウバエの蛹の脳から一次神経細胞培養の準備を示しています。このプロセスには、脳の除去と中脳領域の培養が含まれ、神経突起の伸長とカルシウムイメージングを示しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- ショウジョウバエの蛹は神経細胞培養の準備に使用されます。
- 中脳領域を培養して神経発達を研究します。
- この後期段階で主要な解剖学的構造が形成されます。
- 神経活動を視覚化するためにカルシウムイメージング技術が使用されます。
研究の目的
- 神経細胞培養の準備を示すこと。
- 培養された神経細胞における神経突起の伸長を観察すること。
- 神経細胞内のカルシウムレベルをイメージングするためにFura-2を使用すること。
使用した方法
- 後期のショウジョウバエの蛹から脳の除去。
- 組織解離のための無菌酵素溶液の調製。
- 中脳領域の培養。
- Fura-2を用いたカルシウムレベルのイメージング。
主要な結果
- 一次神経細胞培養の成功した準備。
- 生きた培養における神経突起の伸長の観察。
- イメージングにより培養された神経細胞のカルシウムダイナミクスが明らかに。
- 成体脳の主要な解剖学的構造の実証。
結論
- この方法により神経発達の効果的な研究が可能になります。
- カルシウムイメージングは神経活動への洞察を提供します。
- ショウジョウバエの蛹は神経科学研究の貴重なモデルとなります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Primary neuronal cultures from late stage Drosophila pupae provide a genetically tractable system for studying synaptic formation and function. This model enables mechanistic de-risking of target validation in neuropharmacology by linking genetic manipulation to functional readouts such as calcium dynamics and spontaneous synaptic activity. The system supports early discovery workflows where phenotypic screening and assay development benefit from reproducible, disease-relevant neuronal networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through genetic tools like GAL4-driven fluorescent markers to identify neuronal subpopulations involved in complex behaviors.
- Operational Value: Supports functional target validation via whole-cell recordings demonstrating cholinergic and GABAergic synapse formation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of intrinsic and extrinsic factors influencing central synapse formation and function using pharmacological agents such as nicotine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for preparing validated biological systems amenable to downstream screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent neurite outgrowth and spontaneous calcium transients measurable with Fura-2 dye.
- Scalability: Supports platform reuse across transgenic and mutant lines for reliable compound evaluation in centralized discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Offers mechanistic de-risking value by connecting genetic manipulation in Drosophila to functional neuronal phenotypes relevant to conserved synaptic pathways.
- Preclinical Model Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling intrinsic and extrinsic regulators of synapse function in a genetically accessible system.
- Biomarker Alignment: Enables identification of fluorescently labeled neuronal populations (e.g., GFP-positive Kenyon cells) for tracking target engagement and pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing a genetically manipulable, functionally active neuronal system suitable for phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via genetic dissection of neuronal subpopulations using GAL4 lines and fluorescent reporters.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible neurite regeneration and quantifiable calcium imaging outputs using Fura-2 to monitor spontaneous and drug-evoked responses.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements such as intracellular calcium transients and spontaneous synaptic activity to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conservation of cholinergic and GABAergic neurotransmission mechanisms relevant to mammalian models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across multiple genotypes and experimental conditions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of functional synapse formation and activity-dependent calcium signaling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined dissociation protocols and consistent plating density (~10,000 cells per brain).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage neurotarget assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on genetically defined neuronal circuits and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, enzymatic tissue dissociation, and live-cell imaging techniques.
- Dependent on sterile dissection tools, enzyme solutions (e.g., papain), and CO2-controlled incubation for culture maintenance.
- Necessitates standardization across teams for consistent brain extraction, mechanical dissociation, and plating procedures.
- Adaptation considerations include variability in neuronal yield across genotypes and the need for optimization of dissociation time based on developmental stage.
- Practical limitations include post-dissociation neurite sheering requiring regeneration time and potential variability in process elaboration during early culture days.
