Name: 後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 学ぶ後期ステージショウジョウバエ蛹の脳から初代神経培養を作製する方法。中枢脳領域を培養し、神経突起の伸長とカルシウムイメージングによる神経活動の可視化を実現します。

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培養の一日前の準備： <ol><li>無菌解剖ソリューションとなります。 </li><li>滅菌DMEMを作成し、2週間に4℃で10mlのアリコートにしてください。 </li><li> 1ヶ月に50または100μlアリコートで滅菌DDM2サプリメントや凍結を行います。 </li><li>錯那/ラミニンください。 </li><li>コー​​トのカバースリップ。 オプション：最大4ヶ月間冷凍無菌CNBMや店舗を作る。 </li></ol>培養の日に I.は、層流フードで酵素液（ES）を準備<ol><li> 15 ml遠心チューブに溶液（DS）の解剖を5mlを入れてください。 </li><li> 0.6ミリリットルエッペンドルフのL -システインの0.8 mgを秤量し、DSを150μlを加える。結晶がなくなるまで、最大ピペッティングしてダウン。 </li><li> 5mlのDSにDS /システインの150mlを加え、よく混ぜる。 </li><li>パパインの50 U（ユニット）を追加します。 </li><li> 0.1 NのNa OH 7 mlを加え、よく混ぜる。解決策は、30分以内にクリアされます。アクティブになったとき。 </li><li>滅菌済み1.5 mLスクリューキャップマイクロチューブに0.2 mmのシリンジフィルターとフィルター酵素溶液 パパイン：5 mlのDSで50 Uが欲しい。各バッチはわずかに異なっているので、どれだけ計算する必要があります。 37.3 mg / mlのおよび28.3 U / mgの 37.3 X 28.3 = 1055.59 U / mlの（1000 ml）を 50 U = 47.4ミリリットル </li></ol> II。 DDM2メディアを作る培養の当日：DDM2を作るために、以下のサプリメントを追加するにDMEMを10mlだけ培養する前に、サプリメントを追加します。 <ol><li> 100μlのトランスフェリン</li><li> 100μlのプトレシン</li><li> 100μlのセレン</li><li> 100μlのプロゲステロン</li><li> 50μlのインスリン</li><li> 10μlの20 - ヒドロキシ</li></ol> 注 ：計画、すべての文化のために十分なDDM2確認（各脳は個々の35ミリメートルペトリ皿、メディア/文化の1.5ミリで、単一のカバースリップ上に播種） ステップは、III - VIは行わ非無菌実験台にすることができ、45分以内で完了する必要があります。 III。蛹コレクション<ol><li>解剖顕微鏡下でバイアルの側面10から15サナギを選択します。 </li><li>乾燥35ミリメートルのペトリ皿の蓋で蛹を置きます。 </li></ol> 注 ：我々は一般的に蛹殻形成（APF）の後に55〜78時間の間に蛹から脳を使う。頭部カプセルが崩壊する傾向があるので、神経突起伸長の全体的なレベルは、最古のサナギからわずかに低くなっている間は、若い蛹から脳を解剖することが少し難しくなります。カントン- S野生型株では、これらのステージは別の場所で少し顔料で、やや赤みを帯びた茶色に軽い色素沈着の目で認識されます。 IV。解剖顕微鏡下で断頭<ol><li>蛹の横の場所ペトリ皿の蓋で滅菌解剖ソリューションの2滴を、。 </li><li>そっと左手で細かい鉗子を持つ単一の蛹を保持し、蛹の前端でキューティクルを削除するには右側に1 ccシリンジに接続された27ゲージの注射針を使用してください。 </li><li>鉗子で少し蛹をつまんで、頭が現れるように首を切断するために27ゲージの針を使用してください。 </li><li>針や鉗子の先端で、ソリューションを解剖からドロップする頭を転送する。 </li><li>単一のドロップの10〜15頭になるまで繰り返します。 </li></ol>解剖顕微鏡下で頭部から脳のV.除去<ol><li>それぞれの手に27ゲージの針を1 ccシリンジを保持する。 </li><li>口吻が手前になると頭の背側表面が北になるようなソリューションを解剖のドロップでフライヘッドを配置するためにこれらを使用してください。 </li><li>頭を突き止めると、腹側から背側表面に行く右目にスリットを行う権利針を使用して口吻に左針を挿入します。 </li><li>口吻の領域で左の近くに右の針を挿入し、ゆっくりと右眼のスリットに向かって脳を押すと、左眼上のキューティクルを抑制するために左針を使用してください。脳は多くの場合、光LOの両方で、相対的に無傷の、右側のスリットから出てくるはずBESは同様にまだ取り付けられており、場合によっては色素性眼組織。 </li><li>針と新しい滅菌は35mmシャーレ内滅菌解剖生理食塩水の低下への転送の後ろに脳をプッシュします。 </li><li>各遺伝子型10-15脳を収集する。 </li></ol> VI。光のローブと酵素処理の除去<ol><li>それぞれの手に27ゲージの針で1 ccシリンジを保持し、解剖溶液の液滴の小さな領域内のすべての脳を収集するためにこれらを使用して</li><li>文化のために残っている組織は、中央の脳の領域であるように、各脳から光のローブを削除するには、切削工具としてシリンジを使用してください。 </li><li>無菌パパイン溶液1mlを含むエッペンドルフチュー​​ブに、単一の遺伝子型のすべての脳を転送するために、5μlの時に設定を20μlpipetmanを、使用してください。 </li><li>脳は60 rpmで回転体セットで10-15分間パパインでインキュベート。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心する。 </li></ol>無菌層流フードの内側 - 組織が空気にさらされているすべての手順の残りの手順のために層流フードで行う必要があります。 VII。洗浄<ol><li>酵素溶液を除去し、無菌解離溶液を交換してください。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心する。 </li><li>無菌解離液で3回の合計を洗ってください。 </li><li>解剖生理食塩水を削除するとDDM2を交換してください。 </li><li> DDM2で2回の合計を遠心して洗浄。 </li><li>滅菌35ミリメートルシャーレに脳とメディアを転送する。 </li></ol> VIII。解剖顕微鏡下で粉砕し、めっき<ol><li>カバーの中央にDDM25μlのを置きます。 </li><li>黄色の先端とDDM2のこのドロップを1脳を転送する。 </li><li>顕微鏡下で、小さな断片（&lt;1分を取るべきである）に脳をダイシングするために27ゲージの針を使用してください。 </li><li>視覚的な指導の下で、大きな断片が静かにピペットの先端に吸い込まや培地中に戻って追放することができるように細かい点に引かれているガラスピペットの先端を破る。我々は、100μlのヘマトクリット毛細管ガラスが標準装備されて口の吸引管を使用。 注意 ：メディアの気泡を取得しないように注意してください、あなたは経験的に使用する最適なサイズのピペットを決定する必要があります。良いものは、約30秒/脳の中で、いくつかの個々のセルとまだいくつかの大きな塊で脳を解離することができます。あなたがより高い電力でこれらを見たとき、ニューロンの約10〜20％は、まだいくつかのプロセスが残っているはずですし、まだいくつかの大きな塊があるでしょう。あなたはあまり解離の場合は、すべての細胞が円形になり、彼らは生き残ることはありませんので、多くの被害を被っているでしょう。このステップでは、練習を取り、迅速に変更できる大きな表面積対体積の比とDDM2のドロップの浸透圧やpHがあるので、迅速に行う必要があります。組織は、可能な限り迅速にCO 2インキュベーター内に配置する必要があります。 </li><li> &quot;遺伝子型、日付と時刻&quot;：ペトリ皿の蓋に書いてください。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿（ウェットキムワイプを使用）が35ミリメートルのペトリ皿を置き、30分間CO 2インキュベーター内で解決しましょう。 </li><li> DDM2 1.5 mlの35 mmディッシュをあふれさせる。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター（23℃）でのインキュベーターで培養してください。 注意 ：冷却CO 2インキュベーターへのアクセス権がない場合は、標準的な哺乳動物の組織培養インキュベーターを使用し、どちら° C、または研究室に入れ、温度をオフにし、使用する23に涼しい部屋と暑さの中に入れ周囲の周囲温度を調節するためにインキュベーターの下部にあるトレイに氷。 </li></ol> IX。摂食細胞<ol><li> CNBM/B27：1日目（翌日）に、3:1 DDM2を作るCNBM/B27の0.5ml（馴化培地）を追加します。 </li><li> CNBM/B27：5日目に3時01分DDM2用培地1 mlを交換してください。 </li><li> CNBM/B27ごとに4-5日：3:1 DDM2で餌細胞を保管してください。 注 ：培養物は、非神経細胞馴化培地に栽培が神経細胞が少し壊れやすく表示され、電気生理学的実験で使うために、より困難であることができる。 </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
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<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

彼らは神経突起を拡張し、機能的なシナプス結合を形成する場所胚/出生後のげっ歯類の脳から採取した神経細胞は初代培養細胞で増殖させることができる。これらの培養物の調製方法は十分に確立されており、げっ歯類ニューロン培養の研究は、シナプス形成と機能の調節（バンカーとゴズリン、1991）に関与する遺伝子と環境要因を特定する上で重要な役割を果たしている。様々な種から昆虫のニューロンはまた文化の中で成長することができるが、文化の中で機能的なシナプス結合を形成するために示される唯一の昆虫のニューロンは、ショウジョウバエ（ロールボーら、2003）からです。定義されているメディアで栽培中期原腸段階のショウジョウバエの胚を採取した神経芽細胞は電気的興奮性と形態、機能、ニューロン間のシナプス結合（;リーとオダウド、1999オダウド、1995）であるニューロンを生じさせる。我々は後期ショウジョウバエ（蘇とオダウド、2003）の脳から収穫し、培養神経細胞のためのこのビデオで示した手法を開発した大人の行動を媒介に関与することが知られているニューロンのシナプス形態と機能を調節する因子を同定する。この手順の主な特徴の1つは、パパイン、代わりのコラゲナーゼまたは伝統的に昆虫のニューロン培養の調製に使用される他の過...

コー​​ティングのカバースリップ：60ミリメートルのペトリ皿にオートクレーブカバースリップを入れて。コンのピペットで5μlの各カバーの中央に/ラミニンミックス。 2時間37℃インキュベーター内の場所。オートクレーブ処理水100μlの各々に3倍のカバーグラスを洗浄します。滅菌パスツールピペットに接続された真空を使用してください。すすぎの最後の時には、ピンセットでカバーグラスを拾うと、両側を乾燥させる。 35ミリメートルペトリ皿にカバースリップを転送する。月まで室温で保管してください。

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

このビデオでは、我々は後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。手順は蛹殻形成後70〜78時間で動物からの脳の除去から始まります。分離された脳は、無血清増殖培地で数回の洗浄に続いて、パパインで短いインキュベーションの後に表示されます。カバースリップ上のメディアの5μlのドロップで各脳の機械的解離のプロセスが図示されている。有糸分裂後のニューロンの軸索と樹状突起は、解離中に相馬の近くにオフsheeredしかしニューロンは、メッキの数時間内のプロセスを再生成を開始されています。画像は2日間でライブの文化を示しています。神経細胞は、培養中の最初の週の間にプロセスを詳しく説明し続ける。特定の神経集団は、GFPやRFPなどの蛍光マーカーの組織特異的発現を駆動するためにGAL4ラインを使用して文化の中で識別することができます。全セルの録音は、機能的、自発的にアクティブなコリン作動性およびGABA作動性シナプスを形成する培養神経細胞を実証している。短いビデオセグメントは、培養神経細胞の皿で自発的カルシウムトランジェントとニコチン誘発カルシウム応答を監視するためにカルシウム指示薬としてフラ-2を用いて培養神経細胞でのカルシウム動態を示しています。これらの蛹の脳の文化は遺伝的および薬理学的ツールは、中央のシナプスの形成と機能に影響を与える内因性および外因性の要因を識別するために使用できる有用なモデルシステムです。

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。

このビデオでは、後期段階のショウジョウバエ（Drosophila）蛹の脳から、一次ニューロン培養を調製する方法を実演します。手順は、...から始まります。

私はDiana Dowdです。UC Irvineの解剖学・神経生物学および発生・細胞生物学部門の教授を務めています。本日は、ショウジョウバエの蛹からの神経細胞培養の調製について解説します。この手法では、後期の蛹から脳を取り出し、一般的に中脳領域のみを培養します。この段階で、成体脳に存在する主要な解剖学的構造はすでに形成されています。これには、キノコ体にまで軸索を伸ばす投射ニューロンが存在する触角葉や、α、β、γ葉を通じて標的ニューロンに軸索を伸ばしているキノコ体ニューロンであるケニアン細胞が含まれます。培養当日、まず最初に行うのは、ラミナーフローフード内で、組織を解離させるために使用する酵素溶液を無菌的に調製することです。また、細胞の培養に使用する培地を調製します。これは、あらかじめ準備しておいたストックを用いて作製します。次のステップは、細胞分離または解剖に使用するピューピーを回収することです。これらの個体は酵母などの様々な物質を含むバイアルの中で飼育されているため、この操作はクリーンベンチの外で行います。そのため、解剖の初期段階は実際、クリーンベンチの外で実施します。これらはバイアルの側面から取り出したばかりの個体で、左側の列にある個体は目が赤くなっており、培養に適した段階にあります。こちらにあるこれらのPPPは、わずかに若いです。目はオレンジ色または黄色をしており、これは1 0 7系統の個体です。通常、この段階の野生型の目はもう少し茶色い色をしていますが、これらの個体はそれよりもわずかに明るい色をしています。これらの段階はすべて、ヒトの脳培養を行うための培養に適しています。まず最初のステップとして、シャーレの中に並べて取り出した瞳孔のすぐ横に、解剖用溶液を数滴滴下します。ここでは35mmシャーレの蓋を使用しています。次に、左手に5番のピンセットを、右手に27ゲージの針を装着した1 CCの結核用シリンジを持ちます。これらが2つの解剖器具となります。蛹のケース（蛹殻）から頭部を取り出すには、まず左手のピンセットで蛹を固定し、次に右手の針を用いて蛹殻の前部を取り除きます。次に、キューティクルの被覆を元に戻すと、頭部が前方から飛び出します。その後、針を用いて首の部分を切断し、頭部を採取して解剖用生理食塩水の滴中に置きます。良好な培養を行うためには、各遺伝子型につき10から15匹の個体が必要であるため、この手順を10から15回繰り返します。それでは、動物の頭部から脳を取り出します。そのために、27ゲージの針を装着したツベルクリン注射器を2本使用します。1本の針を動物のpsidに直接刺し、頭部をペトリ皿の底に固定します。次に、右側の針を使用して右側に切り込みを入れます。ここから脳を押し出します。それでは、次のステップとして、左側の針を左眼の上に置きます。そして、実際に押し出すと、脳が右側の切り込みから出てきます。ここに見えてきました。右側に確認できます。ここから右手の針を使って、頭部カプセルや眼の残りの部分から分離します。よし。それでは、最後の解剖操作である視葉の除去を行う前に、脳を清潔な生理食塩水の滴へと移します。ピペットマンを使用して行うことができ、20 µLのピペットマンのチップの先端で吸い上げ、5 µLに設定して使用します。また、実際に針を用いて転移させることも可能です。これが解剖手順の最終段階となります。これは新鮮な生理食塩水の滴の中で行われ、通常、ここには10から15個の脳を用意します。次に、27ゲージの針を切断ツールとして使用し、それぞれの脳から視葉を除去します。各脳の左視葉を切断し、続いて右視葉を切断します。このように処理したすべての脳を、酵素解離に使用する酵素溶液が入ったチューブに移します。同一ジェノタイプ（遺伝子型）の脳はすべて、1 mLの酵素溶液を含む単一のエピスクリューキャップ付きエッペンドルフチューブに入れます。次に、それらを試験管ホルダーに入れ、ローテーターにセットして、室温で10分から15分間静置します。これが実際の解離時間となります。酵素解離ステップを完了させるには、実際に酵素を除去する必要があります。次に、チューブをEOR遠心機に移し、遠心機にセットして、3000 RPMで3分間遠心分離します。脳組織を遠心分離した後、層流クリーンベンチに移動します。ここから手順の滅菌操作が始まります。ラミナーフローフード内にある場合を除き、チューブは開けません。ここで酵素溶液を除去します。その後、解剖溶液に置換し、解剖溶液および最終的に細胞の培養に使用するDefined mediumを用いて、数回の遠心分離と洗浄を行います。以上です。まず最初に行うのは、これらのペトリ皿に入っている各カバーガラスの上に、生理食塩水を5 µLずつ滴下することです。ペトリ皿1枚につきカバーガラスが1枚入っており、ラミニンでコーティングされています。カバーガラスのちょうど中央に、ラミニンが塗布されている箇所へ5 µLの滴下を行います。細胞を視野の中央に集中させることが非常に重要です。なぜなら、脳1つあたり約10,000個の細胞が得られ、それで単一の培養を行うからです。では、顕微鏡で確認しましょう。ここに、すでに酵素解離処理を終えた9つの脳があります。まだほぼそのままの形態を維持しているのがわかります。これらには視葉がありません。視葉は除去されており、中脳領域のみが残っています。ここからピペットで脳を1つずつ吸い上げ、カバーガラス上の5 µLの液滴に移動させます。この操作を4回繰り返します。1 CCシリンジ2本に27ゲージの針を取り付けます。繰り返しますが、これらは非常に安価で使い捨て可能な解剖道具であるため、学部生の方でも予算を気にせずに実施できる点が非常に重要です。では、2本の針を使って、まず機械的な解離を行います。具体的には、この脳をいくつかの断片に切り分けます。これにより、後ほどガラスピペットでこれらの断片を吸引し、最終的な解離を完了させることができます。この操作を行う際は、組織を極めて微細な断片にするのではなく、全体のサイズを小さくすることだけを目的としています。これにより、解離の際にピペットで吸引する断片が、脳全体よりもわずかに小さくなるようにします。また、培地の液滴が小さいことに留意し、比較的迅速に作業を行う必要があります。これは比表面積が高いため、長時間放置すると溶液のpHと浸透圧の両方が変化する可能性があるためです。最初に取り組んでいた時は、一度に2つの脳、2つの培養のみを行っていました。現在は通常4つ行っています。ここでピペットを破損させてしまいそうですが、それについて言及することはできませんね。こちらはちょうど終わったところです。解離が進み、ピペットのサイズが適切でした。組織を数回吸い上げ、排出することができ、個々の細胞が見えてきます。まだ凝集塊が残っていますが、問題ありません。これらは洗浄によって取り除かれます。次に、プレートに播種した直後の培養物を2枚目のペトリ皿に入れ、数分以内にCO2インキュベーターに配置します。これは、生存を維持するために必要なpHと浸透圧を確実に保持するためです。その後、ディッシュを浸水させる前に30分間ここで静置します。なお、これらの培養物は後期蛹の脳から調製したものです。培養物はCO2インキュベーターで2日間培養されており、突起を伸ばした個々の細胞が確認できます。突起の伸展度は、5日目の状態よりは低く、1日目の状態よりは高い程度です。私はJorge Anoです。私はDoubts研究室で働いています。先ほど調製した瞳孔培養細胞を用いて、カルシウムイメージング実験をどのように行うかについて、今からお見せします。これはカルシウムイメージング実験の動画で、青色の細胞はカルシウムレベルが低いことを示し、赤色の細胞はカルシウムレベルが高いことを示しています。一部の細胞が赤色に変化するのがわかりますが、これは細胞内カルシウム濃度の増加を示しています。これらの反応は自発的かつ一過性であり、時間の経過とともに基底状態のカルシウム濃度に戻ります。しばらくした後、今回はニコチンという薬剤を投与しますが、これにより細胞内のカルシウム濃度が上昇するのが観察できます。ニコチンを100秒間投与し、その後ニコチンを除去すると、細胞は基底カルシウムレベルに戻ります。この培養システムの真の利点は、さまざまなニューロンのサブポピュレーションがGFPで標識された、異なるトランスジェニックおよび変異系統のハエから培養ができることです。これは、学習や記憶などの複雑な行動の媒介に関与するニューロンであるキノコ体（mushroom body）のKenyon細胞にGFPが発現している、使用した系統の一つの脳です。細胞体は、赤色の矢印で示された領域付近の脳の背側に位置しています。そして、GFP陽性であるこれらのL字型の構造は、実際にはこれらのキノコ体ケンヤン細胞からの軸索投射です。この脳組織を解離させた後、ニューロンは培養下で突起を再生させるため、この場合、GFP陽性のKenyan細胞を容易に識別することができます。これらの細胞は、標準的な電気生理学的記録とカルシウムイメージング研究の両方に利用可能です。したがって、これらの培養系は、成体動物における複雑な行動の媒介に重要であることが分かっているニューロンの機能調節に寄与する、遺伝的および環境的要因を探索するための非常に有用なツールとなります。

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