Name: 後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 学ぶ後期ステージショウジョウバエ蛹の脳から初代神経培養を作製する方法。中枢脳領域を培養し、神経突起の伸長とカルシウムイメージングによる神経活動の可視化を実現します。

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この作品は、DKODにNIHの助成金NS27501によってサポートされていました。この作業のための追加サポートがHHMIの教授プログラムを通じてDKODのサポートでUCアーバイン校への助成金によって提供されていました。

培養の一日前の準備： <ol><li>無菌解剖ソリューションとなります。 </li><li>滅菌DMEMを作成し、2週間に4℃で10mlのアリコートにしてください。 </li><li> 1ヶ月に50または100μlアリコートで滅菌DDM2サプリメントや凍結を行います。 </li><li>錯那/ラミニンください。 </li><li>コー​​トのカバースリップ。 オプション：最大4ヶ月間冷凍無菌CNBMや店舗を作る。 </li></ol>培養の日に I.は、層流フードで酵素液（ES）を準備<ol><li> 15 ml遠心チューブに溶液（DS）の解剖を5mlを入れてください。 </li><li> 0.6ミリリットルエッペンドルフのL -システインの0.8 mgを秤量し、DSを150μlを加える。結晶がなくなるまで、最大ピペッティングしてダウン。 </li><li> 5mlのDSにDS /システインの150mlを加え、よく混ぜる。 </li><li>パパインの50 U（ユニット）を追加します。 </li><li> 0.1 NのNa OH 7 mlを加え、よく混ぜる。解決策は、30分以内にクリアされます。アクティブになったとき。 </li><li>滅菌済み1.5 mLスクリューキャップマイクロチューブに0.2 mmのシリンジフィルターとフィルター酵素溶液 パパイン：5 mlのDSで50 Uが欲しい。各バッチはわずかに異なっているので、どれだけ計算する必要があります。 37.3 mg / mlのおよび28.3 U / mgの 37.3 X 28.3 = 1055.59 U / mlの（1000 ml）を 50 U = 47.4ミリリットル </li></ol> II。 DDM2メディアを作る培養の当日：DDM2を作るために、以下のサプリメントを追加するにDMEMを10mlだけ培養する前に、サプリメントを追加します。 <ol><li> 100μlのトランスフェリン</li><li> 100μlのプトレシン</li><li> 100μlのセレン</li><li> 100μlのプロゲステロン</li><li> 50μlのインスリン</li><li> 10μlの20 - ヒドロキシ</li></ol> 注 ：計画、すべての文化のために十分なDDM2確認（各脳は個々の35ミリメートルペトリ皿、メディア/文化の1.5ミリで、単一のカバースリップ上に播種） ステップは、III - VIは行わ非無菌実験台にすることができ、45分以内で完了する必要があります。 III。蛹コレクション<ol><li>解剖顕微鏡下でバイアルの側面10から15サナギを選択します。 </li><li>乾燥35ミリメートルのペトリ皿の蓋で蛹を置きます。 </li></ol> 注 ：我々は一般的に蛹殻形成（APF）の後に55〜78時間の間に蛹から脳を使う。頭部カプセルが崩壊する傾向があるので、神経突起伸長の全体的なレベルは、最古のサナギからわずかに低くなっている間は、若い蛹から脳を解剖することが少し難しくなります。カントン- S野生型株では、これらのステージは別の場所で少し顔料で、やや赤みを帯びた茶色に軽い色素沈着の目で認識されます。 IV。解剖顕微鏡下で断頭<ol><li>蛹の横の場所ペトリ皿の蓋で滅菌解剖ソリューションの2滴を、。 </li><li>そっと左手で細かい鉗子を持つ単一の蛹を保持し、蛹の前端でキューティクルを削除するには右側に1 ccシリンジに接続された27ゲージの注射針を使用してください。 </li><li>鉗子で少し蛹をつまんで、頭が現れるように首を切断するために27ゲージの針を使用してください。 </li><li>針や鉗子の先端で、ソリューションを解剖からドロップする頭を転送する。 </li><li>単一のドロップの10〜15頭になるまで繰り返します。 </li></ol>解剖顕微鏡下で頭部から脳のV.除去<ol><li>それぞれの手に27ゲージの針を1 ccシリンジを保持する。 </li><li>口吻が手前になると頭の背側表面が北になるようなソリューションを解剖のドロップでフライヘッドを配置するためにこれらを使用してください。 </li><li>頭を突き止めると、腹側から背側表面に行く右目にスリットを行う権利針を使用して口吻に左針を挿入します。 </li><li>口吻の領域で左の近くに右の針を挿入し、ゆっくりと右眼のスリットに向かって脳を押すと、左眼上のキューティクルを抑制するために左針を使用してください。脳は多くの場合、光LOの両方で、相対的に無傷の、右側のスリットから出てくるはずBESは同様にまだ取り付けられており、場合によっては色素性眼組織。 </li><li>針と新しい滅菌は35mmシャーレ内滅菌解剖生理食塩水の低下への転送の後ろに脳をプッシュします。 </li><li>各遺伝子型10-15脳を収集する。 </li></ol> VI。光のローブと酵素処理の除去<ol><li>それぞれの手に27ゲージの針で1 ccシリンジを保持し、解剖溶液の液滴の小さな領域内のすべての脳を収集するためにこれらを使用して</li><li>文化のために残っている組織は、中央の脳の領域であるように、各脳から光のローブを削除するには、切削工具としてシリンジを使用してください。 </li><li>無菌パパイン溶液1mlを含むエッペンドルフチュー​​ブに、単一の遺伝子型のすべての脳を転送するために、5μlの時に設定を20μlpipetmanを、使用してください。 </li><li>脳は60 rpmで回転体セットで10-15分間パパインでインキュベート。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心する。 </li></ol>無菌層流フードの内側 - 組織が空気にさらされているすべての手順の残りの手順のために層流フードで行う必要があります。 VII。洗浄<ol><li>酵素溶液を除去し、無菌解離溶液を交換してください。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心する。 </li><li>無菌解離液で3回の合計を洗ってください。 </li><li>解剖生理食塩水を削除するとDDM2を交換してください。 </li><li> DDM2で2回の合計を遠心して洗浄。 </li><li>滅菌35ミリメートルシャーレに脳とメディアを転送する。 </li></ol> VIII。解剖顕微鏡下で粉砕し、めっき<ol><li>カバーの中央にDDM25μlのを置きます。 </li><li>黄色の先端とDDM2のこのドロップを1脳を転送する。 </li><li>顕微鏡下で、小さな断片（&lt;1分を取るべきである）に脳をダイシングするために27ゲージの針を使用してください。 </li><li>視覚的な指導の下で、大きな断片が静かにピペットの先端に吸い込まや培地中に戻って追放することができるように細かい点に引かれているガラスピペットの先端を破る。我々は、100μlのヘマトクリット毛細管ガラスが標準装備されて口の吸引管を使用。 注意 ：メディアの気泡を取得しないように注意してください、あなたは経験的に使用する最適なサイズのピペットを決定する必要があります。良いものは、約30秒/脳の中で、いくつかの個々のセルとまだいくつかの大きな塊で脳を解離することができます。あなたがより高い電力でこれらを見たとき、ニューロンの約10〜20％は、まだいくつかのプロセスが残っているはずですし、まだいくつかの大きな塊があるでしょう。あなたはあまり解離の場合は、すべての細胞が円形になり、彼らは生き残ることはありませんので、多くの被害を被っているでしょう。このステップでは、練習を取り、迅速に変更できる大きな表面積対体積の比とDDM2のドロップの浸透圧やpHがあるので、迅速に行う必要があります。組織は、可能な限り迅速にCO 2インキュベーター内に配置する必要があります。 </li><li> &quot;遺伝子型、日付と時刻&quot;：ペトリ皿の蓋に書いてください。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿（ウェットキムワイプを使用）が35ミリメートルのペトリ皿を置き、30分間CO 2インキュベーター内で解決しましょう。 </li><li> DDM2 1.5 mlの35 mmディッシュをあふれさせる。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター（23℃）でのインキュベーターで培養してください。 注意 ：冷却CO 2インキュベーターへのアクセス権がない場合は、標準的な哺乳動物の組織培養インキュベーターを使用し、どちら° C、または研究室に入れ、温度をオフにし、使用する23に涼しい部屋と暑さの中に入れ周囲の周囲温度を調節するためにインキュベーターの下部にあるトレイに氷。 </li></ol> IX。摂食細胞<ol><li> CNBM/B27：1日目（翌日）に、3:1 DDM2を作るCNBM/B27の0.5ml（馴化培地）を追加します。 </li><li> CNBM/B27：5日目に3時01分DDM2用培地1 mlを交換してください。 </li><li> CNBM/B27ごとに4-5日：3:1 DDM2で餌細胞を保管してください。 注 ：培養物は、非神経細胞馴化培地に栽培が神経細胞が少し壊れやすく表示され、電気生理学的実験で使うために、より困難であることができる。 </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
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<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

彼らは神経突起を拡張し、機能的なシナプス結合を形成する場所胚/出生後のげっ歯類の脳から採取した神経細胞は初代培養細胞で増殖させることができる。これらの培養物の調製方法は十分に確立されており、げっ歯類ニューロン培養の研究は、シナプス形成と機能の調節（バンカーとゴズリン、1991）に関与する遺伝子と環境要因を特定する上で重要な役割を果たしている。様々な種から昆虫のニューロンはまた文化の中で成長することができるが、文化の中で機能的なシナプス結合を形成するために示される唯一の昆虫のニューロンは、ショウジョウバエ（ロールボーら、2003）からです。定義されているメディアで栽培中期原腸段階のショウジョウバエの胚を採取した神経芽細胞は電気的興奮性と形態、機能、ニューロン間のシナプス結合（;リーとオダウド、1999オダウド、1995）であるニューロンを生じさせる。我々は後期ショウジョウバエ（蘇とオダウド、2003）の脳から収穫し、培養神経細胞のためのこのビデオで示した手法を開発した大人の行動を媒介に関与することが知られているニューロンのシナプス形態と機能を調節する因子を同定する。この手順の主な特徴の1つは、パパイン、代わりのコラゲナーゼまたは伝統的に昆虫のニューロン培養の調製に使用される他の過...

コー​​ティングのカバースリップ：60ミリメートルのペトリ皿にオートクレーブカバースリップを入れて。コンのピペットで5μlの各カバーの中央に/ラミニンミックス。 2時間37℃インキュベーター内の場所。オートクレーブ処理水100μlの各々に3倍のカバーグラスを洗浄します。滅菌パスツールピペットに接続された真空を使用してください。すすぎの最後の時には、ピンセットでカバーグラスを拾うと、両側を乾燥させる。 35ミリメートルペトリ皿にカバースリップを転送する。月まで室温で保管してください。

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

このビデオでは、我々は後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。手順は蛹殻形成後70〜78時間で動物からの脳の除去から始まります。分離された脳は、無血清増殖培地で数回の洗浄に続いて、パパインで短いインキュベーションの後に表示されます。カバースリップ上のメディアの5μlのドロップで各脳の機械的解離のプロセスが図示されている。有糸分裂後のニューロンの軸索と樹状突起は、解離中に相馬の近くにオフsheeredしかしニューロンは、メッキの数時間内のプロセスを再生成を開始されています。画像は2日間でライブの文化を示しています。神経細胞は、培養中の最初の週の間にプロセスを詳しく説明し続ける。特定の神経集団は、GFPやRFPなどの蛍光マーカーの組織特異的発現を駆動するためにGAL4ラインを使用して文化の中で識別することができます。全セルの録音は、機能的、自発的にアクティブなコリン作動性およびGABA作動性シナプスを形成する培養神経細胞を実証している。短いビデオセグメントは、培養神経細胞の皿で自発的カルシウムトランジェントとニコチン誘発カルシウム応答を監視するためにカルシウム指示薬としてフラ-2を用いて培養神経細胞でのカルシウム動態を示しています。これらの蛹の脳の文化は遺伝的および薬理学的ツールは、中央のシナプスの形成と機能に影響を与える内因性および外因性の要因を識別するために使用できる有用なモデルシステムです。

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。

このビデオでは、後期段階のショウジョウバエ（Drosophila）蛹の脳から、一次ニューロン培養を調製する方法を実演します。手順は、...から始まります。

私はDiana Dowdです。UC Irvineの解剖学・神経生物学および発生・細胞生物学部門の教授を務めています。本日は、ショウジョウバエの蛹からの神経細胞培養の調製について解説します。この手法では、後期の蛹から脳を取り出し、一般的に中脳領域のみを培養します。この段階で、成体脳に存在する主要な解剖学的構造はすでに形成されています。これには、キノコ体にまで軸索を伸ばす投射ニューロンが存在する触角葉や、α、β、γ葉を通じて標的ニューロンに軸索を伸ばしているキノコ体ニューロンであるケニアン細胞が含まれます。培養当日、まず最初に行うのは、ラミナーフローフード内で、組織を解離させるために使用する酵素溶液を無菌的に調製することです。また、細胞の培養に使用する培地を調製します。これは、あらかじめ準備しておいたストックを用いて作製します。次のステップは、細胞分離または解剖に使用するピューピーを回収することです。これらの個体は酵母などの様々な物質を含むバイアルの中で飼育されているため、この操作はクリーンベンチの外で行います。そのため、解剖の初期段階は実際、クリーンベンチの外で実施します。これらはバイアルの側面から取り出したばかりの個体で、左側の列にある個体は目が赤くなっており、培養に適した段階にあります。こちらにあるこれらのPPPは、わずかに若いです。目はオレンジ色または黄色をしており、これは1 0 7系統の個体です。通常、この段階の野生型の目はもう少し茶色い色をしていますが、これらの個体はそれよりもわずかに明るい色をしています。これらの段階はすべて、ヒトの脳培養を行うための培養に適しています。まず最初のステップとして、シャーレの中に並べて取り出した瞳孔のすぐ横に、解剖用溶液を数滴滴下します。ここでは35mmシャーレの蓋を使用しています。次に、左手に5番のピンセットを、右手に27ゲージの針を装着した1 CCの結核用シリンジを持ちます。これらが2つの解剖器具となります。蛹のケース（蛹殻）から頭部を取り出すには、まず左手のピンセットで蛹を固定し、次に右手の針を用いて蛹殻の前部を取り除きます。次に、キューティクルの被覆を元に戻すと、頭部が前方から飛び出します。その後、針を用いて首の部分を切断し、頭部を採取して解剖用生理食塩水の滴中に置きます。良好な培養を行うためには、各遺伝子型につき10から15匹の個体が必要であるため、この手順を10から15回繰り返します。それでは、動物の頭部から脳を取り出します。そのために、27ゲージの針を装着したツベルクリン注射器を2本使用します。1本の針を動物のpsidに直接刺し、頭部をペトリ皿の底に固定します。次に、右側の針を使用して右側に切り込みを入れます。ここから脳を押し出します。それでは、次のステップとして、左側の針を左眼の上に置きます。そして、実

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生物学

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。...

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

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全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

このビデオは、ショウジョウバエの脳神経幹細胞の静止状態からの再活性化を開始する外因性因子を特定するためのプロトコルを示しています。孵化したばかりの幼虫を解剖して脳を分離し、その後、試験ホルモンの有無にかかわらず培地で培養して、神経幹細胞の再活性化と増殖を誘導するホルモンの可能性を評価します。...

培養ショウジョウバエ脳外植片における神経幹細胞の再活性化の解析

中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。...

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ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。...

培養中の細胞小器官輸送ショウジョウバエ細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

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後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

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このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

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