線虫の同期:同一の発生段階にある線虫の集団を取得する方法

0 閲覧数3:43 • April 30th, 2023

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-細菌の食物源を播種したプレートに、最後の幼虫期にある自家受精ワームを置くことから始めます。幼虫が成熟した成虫に成長するのを待ちますが、ワームの中に卵が豊富になり、皿の上に置かれます。プレートを緩衝液で洗って、卵とワームを収集します。

次に、緩衝液を成虫を溶解する漂白剤溶液と交換します。卵殻によって保護されている胚は、発生の異なる段階にありますが、この治療を生き残ります。次に、漂白剤をバッファーに交換し、胚が成長するのを待ちます。幼虫が餌がない状態で卵殻から孵化すると、最初の幼虫の段階で発育が一時停止します。

幼虫を餌の入った皿に移して、発育を再開します。これにより、残りの幼虫の段階を通じて同期進行が促進されます。

線虫が最後の幼虫期に達したら、餌とFUdR(子孫の生産を防ぐDNA合成阻害剤)を入れた皿に移します。FUdRの存在下での継続的な開発は、不妊の成虫の集団を生成します。この実験では、線虫C.エレガンスの集団を同期させます。

-まず、目的の遺伝的背景を持つL4幼虫を、線虫増殖培地またはNGMプレート上の播種したばかりの大腸菌の芝生に移します。各ひずみに少なくとも2つの100ミリメートルプレートまたは3つの60ミリメートルプレートを使用してください。

適切な成長温度で3〜4日間、またはプレートが多数の卵と妊娠したワームで濃縮されるまで、ワームをインキュベートします。線虫のプレート100ミリメートルあたり約6ミリリットルのM9バッファーを使用して、プレートから卵とワームを洗い流します。ガラス製のパスツールピペットを使用して、卵と線虫を各系統の15ミリリットルの遠心分離管に移します。これらのチューブを6,180gで3分間回転させます。

遠心分離後、動物と卵ペレットのみを保持したままM9バッファーを吸引します。各チューブに3〜4ミリリットルの漂白剤溶液を加え、6分間断続的に渦

巻きます。

次に、M9バッファーを各チューブに充填し、6,180 gで1分間遠心します。上清を吸引し、この洗浄をM9で3回繰り返します。

洗浄後、卵ペレットを約9ミリリットルのM9バッファーを含む新鮮な15ミリリットルのチューブに移します。孵化したばかりのワームを、摂氏20度で16〜48時間刻むことにより、同期させます。

これらのチューブを6,180 gで1.5分間回転させた後、同期したL1動物を、播種したばかりのOP50の芝生に個々のNGMプレートに置きます。動物が約42時間後にL4幼虫期に達するまで、プレートを摂氏20度に保ちます。このとき、プラチナピックを使用して、L4幼虫を1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのFUdRを含むOP50播種NGMプレートに移動させ、子孫を産むのを防ぎます。

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最終更新:15 8月 2026