ショウジョウバエ穴を掘るおよびトンネリングの試金術:ハエの幼虫のティッシュ低酸素率を評価する方法

- 胚収集ケージを設置するには、新鮮な酵母ペーストを添加したブドウジュース寒天プレートを使用し、適切な遺伝子型の雄と雌のショウジョウバエが入ったケージにプレートを置きます。酵母とぶどうジュースの匂いが魅力的で、メスの産卵を促進します。一定の時間産卵を許可します。次に、成虫を取り出し、胚プレートを24時間インキュベートして、最初の幼虫を取得します。次に、グレープジュースプレートから数匹の個々の幼虫を寒天専用の試験プレートにそっと移し、プレートの中央にある寒天の穴を切り取り、酵母ペーストで満たします。

若い幼虫は成長するために体重を増やすために餌をやらなければならないので、彼らは食物源である酵母ペーストに穴を掘ります。彼らが成長するにつれて、幼虫はさまよう段階に入り、蛹化の場所を探すために食物から離れてトンネルを掘ります。低酸素症を評価するには、幼虫が基質に形成するトンネルパターンを調べます。トンネリングが不足している、または不十分な場合は、酸素欠乏の兆候です。プロトコルの例では、穴掘りおよびトンネリングアッセイの設定方法を見ていきます。

- テキストプロトコルに記載されているように、産卵皿のコントロールおよび実験的遺伝的交配を設定します。時限卵の収集を開始する前に、少なくとも2日間はハエを暗闇に置いてください。時限的な卵の収集のために、その日の早い時間に酵母ペーストの新鮮な塗抹標本で飾られた新しいブドウ寒天プレートに成虫を移し、成虫がプレートに卵を産むのを4時間待ちます。4時間後、成虫を新鮮なブドウ寒天プレートに移します。

次に、4時間の収集プレートを摂氏25度で一晩インキュベートします。次の日の午後までに、ほとんどの幼虫が孵化します。実験グループごとに少なくとも 50 個用意することを計画します。

アッセイの 1 回の実行では、実験グループごとに少なくとも 5 つのアッセイプレートを調製します。加熱して、700ミリリットルの脱イオン水に16グラムのフライ寒天を追加します。95%エタノールで17.5ミリリットルのニパジェンを準備します。寒天溶液がほぼ完全に溶解するまで加熱します。次に、寒天溶液にニパジェン溶液を加え、寒天が完全に溶解するまで加熱します。寒天溶液を短時間冷却してから、10センチメートルプレートに15ミリリットルの寒天溶液をロードします。寒天がゲル化したら、プレートに蓋をして、室温で数時間または一晩乾燥させます。

硬化した寒天は、手触りがしっかりしていて、破片を切り出すときに崩れにくくなければなりません。寒天が硬化したら、1.5センチメートルのコルク穴あけ器を使用して、各プレートの寒天ゲルに中央に穴を開けます。次に、新鮮なイーストペーストで穴をきれいに埋めます。

幼虫をアッセイプレートに移すには、簡単なツールを作成します。プラスチック製のマイクロスパチュラの先端にカーブを曲げ、先端をイーストペーストに浸して幼虫に接着させます。次に、最初の幼虫を個別に拾い上げ、フードマウンドの近くの寒天皿に置きます。実験グループごとに、それぞれ10匹の幼虫が入ったプレートを少なくとも5枚用意します。

アッセイの複製間の再現性を確保するためには、各アッセイプレートに10匹の幼虫のみを配置することが重要です。マイクロヘラチップで幼虫を送達するたびに、アッセイプレートを注意深くチェックして、1匹の幼虫のみが移送されることを確認してください。

プレートを装填したら、ラベルを貼って蓋をし、蓋をして室温で暗所に置きます。すべての幼虫が死ぬか蛹になるまで、毎日各プレートを調べます。以下は、アッセイの2日目から8日目までの野生型株のプレートの例です。2日目には、幼虫は餌に埋もれ、トンネルは発生しません。トンネル掘削は3日目に始まり、幼虫がトンネル内でさまようのをやめて蛹になるため、5日目から8日目の間に最大に達します。

曲がったからかい針で蛹をブドウ皿に慎重に移し、必要に応じて、蛹の数を数えます。蛹の形成に注意し、蛹の異常を評価します。