Name: メタゲノムライブラリの大規模スクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: 学ぶメタゲノムライブラリのロボットによる膜フィルターへの大規模コロニー接種法。10,000コロニーの高精度配置とハイブリダイゼーションスクリーニングにより、微生物ゲノム研究の効率と再現性を向上させる革新的アプローチです。

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1。ハイブリダイゼーションの手順ワンハイブリダイゼーションチューブは、1または2膜（22 cmの大きさ22）がかかります。ハイブリダイゼーション混合物を50mlとハイブリダイゼーションチューブあたりのDNAプローブ（10 ng / mlの最終濃度）の0.5mgを使用してください。最良の結果を得るには、プローブとしてゲル精製したDNAを使用してください。プローブ調製スケールアップした場合、チューブの数ではなく、チューブあたり試薬の量を増やすことを増やす。 プローブ調製（0.5mgのDNA）： <ol><li>水60μlで架橋剤溶液15μlを希釈する。 </li><li>スクリューキャップチューブに50μlの合計容積に水では10 ng /μlにDNAを希釈する。 </li><li>沸騰したお湯で5分間変性されたDNA。 </li><li>急速に氷に転送し、5分間冷ます。簡単にスピン。 </li><li>反応緩衝液50μlを加え、穏やかに混ぜる。 </li><li>標識試薬10μlを加え、穏やかに混ぜる。 </li><li>ステップ1から希釈架橋剤溶液50μlを加え、穏やかに混ぜる。穏やかに攪拌し、簡単にスピン。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li>最大2時間まで氷上で維持するか、-20℃で100％のグリセロールとストアの等量を追加する 注：キットに付属の水を使用してください。特に断りのない限り氷上のすべての試薬 ​​を保管してください。 </li></ol>膜調製とハイブリダイゼーション<ol><li>ハイブリダイゼーション緩衝液とハイブリダイゼーションチューブ60への予熱50ミリリットル℃に</li><li>ハイブリダイゼーションチューブにハイブリダイゼーションバッファーを追加します。膜（s）をロールアップするとハイブリダイゼーションチューブに加える。 （チューブあたり2膜、完全に一つの膜上最初のロールを追加する場合は、同じ方向に上に他の膜をロールアップします。） </li><li> 60℃のハイブリダイゼーションチューブをインキュベート℃で少なくとも半時間のためのCを（膜（s）が全身ずぶぬれになることを確認してください。） </li><li>ハイブリダイゼーションチューブから標識プローブを含むチューブに長いピペットでハイブリダイゼーション緩衝液約1mlを転送します。穏やかに攪拌し、簡単にスピン。ハイブリダイゼーションチューブに戻って混合物を移す。 </li><li> 60℃で一晩。 注：使用鉗子と手袋膜を処理する。あまりにも多くの攪拌は望ましくない泡の永続的な形成の原因となるので、ゆっくりとハイブリダイゼーションチューブのコンテンツを混ぜる。膜は湿潤状態で追加する必要があります。追加する前に、必要に応じて、ハイブリダイゼーション緩衝液または水に浸すと余分な水分を切る。 </li></ol> 2。検出の手順洗濯膜<ol><li> 60℃に予熱一次洗浄バッファー（電子レンジ及び/または加熱プレートを使用してください。） </li><li> oneハイブリダイゼーションチューブ2膜がある場合は、きれいに、予熱、空のハイブリダイゼーションチューブに一つの膜を転送する。 </li><li>簡単に言えば一次洗浄バッファーの約50 mlのハイブリダイゼーションチューブをリンス。 </li><li> 60ハイブリダイゼーションチューブとインキュベートする一次洗浄バッファーの約100 mlを加え℃で10分間。 </li><li>ステップ3と4を繰り返します。 </li><li> 5分間室温で二次洗浄バッファーの少なくとも250mlの容器とインキュベートし、洗浄するために膜を移し。 </li><li>手順6を繰り返します。 注：膜が信号生成の前に½時間まで室温で二次洗浄バッファーに保持されることがあります。 </li></ol>信号発生と検出（一つの膜のための手順） <ol><li>卓上へSaranWrapフラットのテープ2個（ステップ2の1つ、ステップ4のいずれか）。 </li><li>慎重に容器の側面に膜の角に触れることにより膜から余分なバッファを切るとSaranWrap（最大試料側）にメンブレンを転送する。 </li><li>膜上の膜と倍サランのラップ上ECF試薬6〜7 mlを注ぐ。慎重にゆっくりとSaranWrap以上キムワイプを移動することによって、細胞膜上のECFの試薬を販売しています。 5分間インキュベートする。 </li><li>メンブレンから過剰なECFの試薬を切ると新しいSaranWrap、膜上の倍のラップの上にそれを転送し、テープで縁をシール。アルミ箔をメンブレンにかぶせ。 1-2時間インキュベートする。 </li><li>ガラス板の上にECFの試薬の1〜2 mlを分散することにより、スキャナのガラス板を準備します。その後、ガラス板上に膜を転送する（下にサンプル側）と膜上のECFの試薬の別の1〜2ミリリットルを配布する。 SaranWrapとオーバーレイと慎重に離れて膜からすべての気泡を押してください。 （これは、ガラス板に押し付け膜を維持するためにSaranWrapの上に硬い板を置くことができます。） </li><li>検出フィルタLPB（510 nm）を、分解能は50μm、16ビットの信号を卒業、CH1 400 V.（スキャン、励起473 nmの：次の設定で富士FLA - 5100蛍光スキャナー（&quot;1レーザ1のイメージ&quot;モード）を使用してください22センチメートルでサイズ22の膜あたり約15〜20分かかります。） 省略可能： </li><li> 2〜4時間（以上）放置します。 </li><li>手順6のようにスキャンする手順を繰り返します。 </li></ol> 3。手順（NUF版）をストリッピングして保存<ol><li> 100％に膜を移しら穏やかに振盪しながら10分間室温でhanolとイ​​ンキュベート。 </li><li>新鮮な100％エタノールで置き換えると、室温で一晩インキュベートする。 （メンブレンは数日間エタノールに残っていることがあります。） </li><li>蒸留水でエタノールを交換し、10分間室温でインキュベートする。 </li><li>ハイブリダイゼーションチューブを100 mlの水と10％SDS（最後の0.5％SDS）を5mlを加え、穏やかに混ぜる。メンブレンを追加。 </li><li> 80℃1時間インキュベート</li><li>きれいな、空の容器にメンブレンを移し。 </li><li> SDS（​​最後の0.1％SDS）電子レンジでの活発な沸騰にビーカーと熱水500mlを加え、10％の5 mlです。 </li><li>膜上にほぼ沸騰0.1％SDS溶液を注ぎ、軽く数分間振とうする。室温に冷却してください。 </li><li>少なくとも10分間滅菌100mMトリスpHを8の少なくとも250 mlでリンス。 </li><li> SaranWrapの膜とテープで慎重に近いエッジを包みます。 4℃で保存します。 （膜が完全に乾くことはない必要があります。） </li></ol>

ストリッピングの手順が最適化されていません。しかし、メーカーの指示（2回洗浄それぞれ、100％エタノールで10分間、60℃0.5％SDSで1時間の1洗浄）で与えられるストリッピングの手順は不十分です。 100％エタノールで少なくとも一晩のインキュベーションでは、ECFの反応生成物を溶解するために必要であり、100％エタノールで数日のインキュベーションでは、メンブレンをリプローブする能力に悪影響がないように見えることがあります。メーカーのSDS処理も不十分なように見えます。 NUFは80℃1時間をしようとした° C、0.5％SDSが成功とほぼ沸騰0.1％SDSで一つの治療が続くと。トレイシーは、一度はほぼ沸騰0.1％SDSでオーバー注ぐことが十分であることが示されている。 役立つヒント： ハイブリダイゼーション緩衝液、ハイブリダイゼーションチューブ、および一次洗浄バッファーを60に予熱する必要があります° C使用前に、実験を通してその温度に保たれている必要があります。例えば、浸漬温度計で加熱板上でバッファを保つ;コーニングの加熱プレート上に、約3結果の設定値を60で℃の

組み合わせパックRPN3692 = RPN3680 + RPN3685

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

前の栽培を必要とせずに微生物から連続したゲノム配列のメタゲノムライブラリのアーカイブ大きい断片。メタゲノムライブラリーを作成し、スクリーニングするための合理化された手順を生成すると、未培養微生物群集の遺伝的および代謝特性に効率的な高スループットの調査に有用である。ここでは、主要なプロトコルは、我々は正確に交互にロボットの計測と（人間の）手動の介入に依存する長いプロセスを記述するための最も有用なフォーマットである提案するビデオ、上に表示されています。最初に、我々は、24 384ライブラリのプレートから重複したコロニーを含むことができるそれぞれの高密度マクロアレイメンブレン上にライブラリークローンを、見つけるためにロボットを採用。オートメーションは、高密度の空間的配置にライブラリークローンの大規模な数に合わせて必要な規模の小型化のためだけでなく、精度と速度のため、この手順が不可欠ですが、。一度生成された、我々は次のマクロアレイメンブレンは、プローブのラベリング、メンブレンハイブリダイゼーション、およびシグナル検出のための標準プロトコルの修正バージョンを使用して、目的の遺伝子をスクリーニングすることができる方法を示しました。我々は、ビデオと一緒にオンラインで利用可能なすべてが詳細に書かれた必要な手順の説明と必要な材料、これらの手順の視覚的なデモンストレーションを補完。

メタゲノムライブラリは、事前の培養を必要とせずに、微生物から得られた連続的なゲノム配列の大きな断片を保存するものである。...の作製は

ここでの目的は、これらのメタゲノムライブラリから得られたコロニーをメンブレンフィルターに接種することです。各フィルターには10,000個のコロニーを保持させることができます。現在行っているのは、このナイロンフィルターをブロックの上に置き、平らに伸ばす作業です。フィルターは少量の液体、つまり増殖培地であるLB培地に浸っています。次に、この湿らせたメンブレンをロボットへと移します。このロボットが、メンブレン上に10,000個のコロニーを自動的に接種します。このような手順においてロボットは不可欠です。なぜなら、1つのメンブレンに10,000個ものコロジーをスポットさせる忍耐強さと正確さを兼ね備えた人間はまずいないからです。非常に反復的な、あるいは微細な空間スケールの操作を高精度に行えるようにしたロボットの導入こそが、ゲノム科学を実際に進歩させた要因の一つとなっています。現在、ロボットを用いて3枚の84ウェルプレートをセットアップしています。これらの84ウェルプレートの各ウェルには、メタゲノムライブラリーからの個別のコロニーが保持されています。現在、ロボットはメンブレン上にスポットするために使用する接種針を滅菌しています。接種針は70% ethanolなどの複数の異なる溶液を通過して滅菌され、その後、すべてのコロニーが含まれている84ウェルプレートに浸されます。現在は光によって滅菌および乾燥が行われています。接種針の乾燥後、ロボットによってプレートが搬送されます。各コロニーは実際にブロッティングされ、重複して採取されます。これにより、コントロールとしての役割を果たします。ハイブリダイゼーションによるシグナルを示す、同一の2つのコロニーを探します。すべてのコロニーをフィルター上にスポットした後、ここに見えるアガロースプレートに敷き、37 °Cで一晩培養します。個々のコロニーが成長し、フィルター上に10,000個のコロニーが配列として並んでいるのがわかります。当然ながら、これらの各コロニーには、組換えDNA（この場合はメタゲノムDNA）が非常に多くコピーされています。これは、我々が作製した北太平洋中央部のサンプルに由来するものです。次に、Saltramはこのメンブレンを一連の溶液へと転移させます。最初に転移させるのは水酸化ナトリウムの塩基性溶液であり、これによりコロニーを溶解させます。これは基本的に細胞壁を溶解してDNAを遊離させ、DNAがフィルターに接触するようにするためです。ここで起こっているのは、コロニー内のすべての細菌の細胞壁が溶解し、DNAが遊離することです。水酸化ナトリウムに5分間浸した後、フィルターを転移させます。これは一時的に置いておく場所であり、次に沸騰した蒸気の中に入れます。これが溶解ステップの第2部です。まず、細胞を水酸化ナトリウムの高アルカリ溶液と界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウムで処理しました。次に、これらのコロニーを100 °Cの高温蒸気で加熱します。その塩基と界面活性剤の組み合わせに熱を加えることで、細胞が完全に溶解し、DNAがフィルター上に遊離します。スチームバスペースでの5分間の処理後、フィルターを中和溶液に移します。中和溶液によって塩基がすべて中和され、その後、フィルターを乾燥させます。これが中和溶液です。この中にさらに5分間浸しておきます。次に、フィルターをブロッティングペーパーに移し、通常は一晩かけて乾燥させます。溶菌細胞が付着したメンブレンを一晩乾燥させた後、Tris、EDTA、およびプロテアーゼKの溶液に浸します。プロテアーゼKは、メンブレン上のすべてのタンパク質を除去するために使用します。膜を裏返しにして、すべてのコロニーにプロテアーゼKが十分に塗布されるようにします。これにより、多くの余分な細胞物質とタンパク質が消化されます。37 °Cで37分間プロテアーゼKを用いてインキュベートした後、膜を溶液から取り出し、ブロッティングペーパー上で一晩乾燥させます。これで、次のステップであるハイブリダイゼーションの準備が整います。私の名前はVin fmです。de Long研究室のポストドクターを務めています。MITでは、系統学的マーカーおよび機能性遺伝子をスクリーニングするために、マクロアレイ技術を用いています。マクロアレイライブラリの調製方法について説明しました。ここからは、スクリーニングを行うための残りの手順について解説します。こちらがマクロアレイです。作業を進める前に、UVによるクロスリンクを行い、DNAをメンブレン自体に固定する必要があります。UVストラタリンカーを用いて、それを導入し、オートクロスリンク（自動架橋）に設定して開始します。架橋処理が終わったら、メンブレンを2等分に切断します。これは、メンブレンをハイブリダイゼーションチューブ内でハイブリダイゼーションさせるためであり、半分に切断することで、メンブレンの内側表面全体をハイブリダイゼーション溶液に完全にさらすことができるからです。メンブレンが巻き込まれることなく、チューブ内に完璧に収まっていることがわかります。これで、ハイブリダイゼーションチューブの中にメンブレンが適切に配置されました。次に、ハイブリダイゼーションバッファーを添加します。60°Cで予熱しておいた別のチューブに入っているプローブを加えます。これが私の推奨するハイブリダイゼーション温度です。それを加える前に、あるいは加えながら説明しますと、ハイブリダイゼーションバッファーは検出キットとともにメーカーから提供されたものを使用しています。ハイブリダイゼーションバッファーを使用し、そこにブロッキング剤を添加します。また、リン酸緩衝液、SDS、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、および少量の尿素が含まれています。それでは、ハイブリダイゼーションバッファー、メンブレン、およびプローブを入れたこのチューブを、60 °Cに設定したハイブリダイゼーションオーブンに入れ、一晩インキュベートします。理想的には一晩インキュベートした後、未結合のプローブを除去するためにメンブレンを洗浄します。ハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブの調製に有害物質は含まれていないため、シンクに廃棄しても安全です。次に、同じく60°Cで温めておいた一次洗浄バッファーを用意します。これは、メンブレンを一晩ハイブリダイズさせていたときと同じ温度で適切に加熱されています。洗浄工程も同様の温度で行います。通常、一次洗浄バッファーを用いて、1回につき約5〜10分間のインキュベーションを伴う洗浄を3回行います。なお、この洗浄バッファーは非放射性であり、既知の有害化学物質も含まれていないため、各洗浄サイクルの後、そのままシンクに廃棄してください。60 °Cの一次洗浄バッファーで3回洗浄したことになります。次に、メンブレンを二次洗浄します。これにより、ECF検出試薬に曝露させるための適切なpHに調整されます。続いて、室温で二次洗浄バッファーを用いてメンブレンを洗浄します。ピンセットを使用してメンブレンを取り出すか、慎重に操作できる場合は、手袋を着用した手で、メンブレンの背面または端のみを持つようにしてください。これにより、手や手袋に付着している可能性のある汚染物質でメンブレンを汚染することを防げます。メンブレンを、あらかじめ調製し室温に戻しておいた二次洗浄バッファーの入った容器に移します。メンブレンを平らに広げて置いてください。メンブレン同士が重なることがありますが、特に問題はありません。この工程は、単に膜のpHを平衡化させるためのものであることを覚えておいてください。その後、そのままインキュベートします。必要に応じて、軽く揺らしても構いません。それが特に有用であるとも、有害であるとも感じませんでした。そのため、再度ベンチ上に5〜10分間放置し、その後、二次洗浄を2回繰り返します。これで、二次洗浄の2回目の洗浄が完了しました。それでは、検出の準備を行います（展開してください）。サランラップを広げ、その上にメンブレンを配置します。検出試薬がメンブレンの上に載るようにし、その後、サランラップを折り返します。これにより、検出試薬を保持するための便利な小さなポーチが作成されます。ここにメンブレンを用意しました。余分な洗浄バッファーを乾いたペーパータオルの束の上に吸い取らせ、メンブレンをTheranラップの上に広げます。あらかじめ調製したECF検出液を用意してください。これらは通常、フリーザーで数ヶ月間保存することが可能です。試薬をメンブレンに注ぎ、残った部分はラップで包んで保存してください。端または縁を折り込むことで小さな袋状にし、検出工程全体をアルミ箔で保護します。そのまま5〜10分ほど放置します。これで、最初のバッグから検出化学物質を排出する時間となりました。cling wrap（ラップ）の一部をベンチにテープで固定しているのがわかるかと思います。ラップ特有の張り付きを防ぐために、このようにすると非常に便利です。また、ペーパータオルの山に軽く当てて水分を切り、ベンチにあらかじめ準備しておいた清潔な新しいラップの上に転がす方法も有効です。検出試薬の処理が概ね完了し、シグナルを十分に発現させるために、メンブレンを約2時間インキュベートする準備が整いました。2時間が経過し、メンブレン上のシグナルを検出します。蛍光スキャナーを用いてメンブレンをスキャンしますが、この際もメンブレンの端のみを持つようにしてください。膜とガラスの間に気泡が生じた場合は、ピペットを使用して気泡を押し出すと有効です。これでスキャニングの準備が整いました。フェイスプレート上で膜が覆っていた領域を設定し、4および73 nmでスキャンします。完了したスキャン画像を拡大すると、この画像のような結果が得られます。ここにシグナルがあります。向かい合う2つのドットがある場合は、それが陽性シグナルの印です。こちらが1つ目の例、そしてこちらが2つ目の例です。このように、メンブレンのどの部分にシグナルがあるかが分かれば、その特定のシグナルがどのプレートのどのウェルに対応するかを遡って確認します。これにより、スクリーニングで同定しようとしていた特定の遺伝子をどのfo smidtが保持しているかが分かります。そして、smidを特定したら、それを探すことができます。一つの方法は、smidインサート全体をシーケンスし、目的の遺伝子を見つけ出すことです。

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