JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 3:32 分 • April 30th, 2023
- 解剖した卵室が入ったカバースリップを顕微鏡ステージに置きます。マイクロインジェクションに適した発達段階と向きの卵室を見つけます。中期から後期の卵室には、大きな目に見える卵黄があり、正しい向きにある卵子は、前後軸が注入方向に垂直になっています。
ショウジョウバエの神経細胞は、母体由来の栄養素と生体分子を発育中の卵子に沈着させる役割を担う卵室内の15個の細胞のグループです。マイクロインジェクターシステムを適切な注入圧力と補償圧力に設定して、一貫した注入量と外向きの流れを確保します。前にロードした毛細血管針を視野に慎重に持ってきて、細胞と針が同じ焦点面にあるようにします。
キャピラリーの先端に空気が閉じ込められていないこと、および溶液が連続的に流れていることを確認してください。次に、対物レンズのZ位置を調整して、卵胞細胞とナース細胞を分離する膜に焦点を合わせ、針をナースセルに挿入して注射を行います。
以下のプロトコルは、生細胞イメージングのための母体提供mRNA転写産物に対して、分子ビーコンと呼ばれる蛍光オリゴヌクレオチドプローブを用いてショウジョウバエ看護師細胞をマイクロインジェクションする方法を示しています。
- モレキュラービーコンマイクロインジェクションの場合は、40倍オイル対物レンズを選択し、解剖した卵チャンバーのカバースリップを顕微鏡ステージに取り付けます。マイクロインジェクションに適した向きの卵室を中期から後期の発達段階に設置し、適切な注入圧力と補償圧力でマイクロインジェクターをセットアップします。
マイクロマニピュレーターのジョイスティックを使用して、1マイクロリットルの分子ビーコン溶液を充填した針をオイルドロップに静かに下げます。先端を視野の周辺に向かってピントを合わせます。針先から空気を取り除き、針からの流れがあることを確認し、針をホームポジションに持ってくるクリーン機能を実行します。
マイクロインジェクションする卵室に焦点を合わせ、針を卵室の端近くに戻します。濾胞細胞をナース細胞から分離する膜に焦点が合うように、対物レンズのZ位置を微調整します。針をナースセルに挿入して、分子ビーコンを2〜5秒間注入します。
- 再現性のあるマイクロインジェクションを成功させるためには、マイクロマニピュレーターで針の先端にピントを合わせながら、卵胞細胞と注入するナース細胞を分離する膜に慎重に焦点を合わせます。
- すべての分子ビーコンが注入されたら、針をそっと取り外してホームポジションに引っ込めます。対物レンズを画像取得の希望の倍率に変更し、新しい対物レンズの下の卵室に焦点を合わせて、画像取得を開始します。