光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

個々の coli 細胞の曲げ剛性を決定するために、まず細菌を対数増殖期まで培養し、化学処理を施したカバースリップ表面に付着させます。表面に付着した細胞をさらに増殖させ、柔軟な末端を発達させます。次に、誘電体ビーズを流し込み、ビーズをトラップして、細胞の柔軟な先端に向けて曲げます。

手順の最終ステップは、光トラップを用いて細胞を曲げ、得られた強制変位データを測定することです。細胞の曲げ剛性は、強制変位データに線形フィッティングを行うことで算出できます。こんにちは、私はプリンストン大学のルイス・シクラー統合ゲノミクス研究所および物理学部のJoshua Shere教授の研究室に所属しているSteven Wongです。

本日は、個々のE. coli細胞を曲げ、細胞の剛性を測定する方法を実演します。当研究室ではこの手法を用いて、細菌細胞の機械的完全性に対するさまざまな細胞内構造の寄与を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、任意のE. coli細胞3 mLをLB培地中で対数増殖期まで培養します。細胞の600 nmにおける吸光度が0.2から0.4に達したら、50 µg/mLのセファレキシンを培養液に添加し、15分間インキュベートして糸状成長を誘導します。この15分間に、フローチャンバーを作成します。

2本の両面テープを、テープ間に3 mmの隙間をあけてガラススライドに貼り付け、その上にカバーガラスをテープで固定します。テープ間の隙間が液体を流すためのチャネルとなります。マイクロピペットを用いて、水で希釈した1% polyethaline 10 µLをフローチャンバー内に流し、5分間インキュベートしてカバーガラスをPEIでコーティングします。

次に、チャンバーの一端から200 µLの水を流し込み、もう一端から真空吸引することで洗浄します。セファレキシン存在下で細菌を15分間培養した後、1 mLの細胞をマイクロ遠心機で遠心分離し、セファレキシンを含む200 µLのLVで再懸濁します。続いて、再びマイクロピペットを一方の端に、真空吸引をもう一方の端に用い、濃縮した細胞培養液50 µLをコーティング済みカバーガラスが入ったチャンバー内に流し込み、3分間インキュベートします。

次に、セファレキシンを添加した50 µLのVel Bで洗浄します。未接着細胞を除去するため、光学トラッピング装置にセットするまでの間、チャンバーを37 °Cで30分から1時間インキュベートし、接着細胞を増殖させます。0.1% Polylysineを水で希釈した液中で、直径0.5 µmのポリスチレンビーズ3 µLを30分間インキュベートし、ポリリシンコートビーズを調製します。

ビーズのインキュベーションが完了したら、マイクロ遠心機でスピンダウンし、1 mLの水で再懸濁させる洗浄操作を3回行います。その後、ビーズを細菌に結合させ、細胞の結合剛性を測定します。本プロトコルで最も困難な点は、曲げ剛性の測定に適した良好な細胞を探索し、特定し、認識することです。良好な細胞とは、固定端と自由端が明確に定義されている細胞のことを指します。

顕微鏡上のフローチャンバー内で、端部が明確に固定されている細胞を探します。細胞によっては一方の先端のみが付着しており、もう一方の先端に曲げ力が加わると、細胞が曲がるのではなく細胞全体が回転してしまう場合があります。適切な細胞を見つけるには、ジョイスティックで制御されるステージ移動を用い、トラップで各細胞を素早く曲げて確認してください。

適切な細胞が見つかったら、ビーズ溶液をセファレキシン含有LB培地で2倍に希釈し、フローチャンバーの一端からピペッティングで30 µLのビーズ溶液を加え、もう一端からKimwipeで緩やかに流し出します。浮遊しているビーズを光トラップで捕捉し、細胞の自由端に接触させます。さらに、50 µLのセファレキシン含有LB培地を用いてマイクロピペットとKimwipeでチャンバー内を洗浄し、付着していないビーズを除去します。次に、独自に作成したLabVIEWプログラムを実行して細胞に曲げ力を加え、強制変位データを記録します。

まず、検出レーザービーム内で付着したビーズをRAスキャンし、3D PSD電圧信号を記録することで、検出器の応答を校正します。次に、顕微鏡画像を用いて細胞の長軸を特定します。細胞の長軸を特定した後、長軸に垂直な方向へ細胞を段階的に移動させながら、移動距離と光トラップの中心からのビーズの変位を記録します。

最後に、あらかじめ測定したトラップ剛性を用いて変位値を印加力に変換し、保存します。ここでファイルに保存されるチップの変位と力は、単一細胞の強制変位データとなります。この直線の傾きが、細胞の曲げ剛性になります。

以上で、E. coliの曲げ剛性を光学トラップに組み合わせる方法を説明しました。この手順を行う際は、固定端と自由端が明確に定義された良好な細胞を見つけることが重要です。これで完了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。