Name: 光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶ光トラップを用いた大腸菌の曲げ剛性測定法。セファレキシン処理によるフィラメント化細胞をカバースリップに固定し、光学トラップで曲げ力を加えて変位データを測定します。細菌細胞の力学特性を非侵襲的に解析する手法です。

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我々は、表面への結合細胞に宅太陽から有用なアドバイスを認めます。我々は、貴重な議論のためにネッドウィングリーンとZemer Gitaiに感謝。この研究は、厚生助成金P50GM07150、国立科学財団のキャリア賞PHY - 0844466とアルフレッドP.スローン財団の国立研究所によってサポートされていました。

<ol><li>指数増殖期（OD = 0.2〜0.4）へのルリア - Beltraniブイヨン（LB）培地で大腸菌の細胞を成長する。 </li><li> 15分糸状成長を誘導し、遠心分離によって5回で文化を集中させるためのセファレキシンの50μg/ mLのを補充したLBの文化を成長する。 </li><li>フローチャンバーに水で希釈した1％のポリエチレンイミンを流すことによりPEIでコーティングされたカバースリップを作り、5分間のインキュベーション後、水で洗ってください。 </li><li>チャンバー内に濃縮された細胞培養を流れる、と結合されていない細胞を除去するために3分後にLBとセファレキシン（50μg/mL）の混合物で洗浄した。 </li><li> 37室のインキュベート° Cは、添付細胞が光トラッピング装置での配置の前に成長させること30分、1時間。 </li><li> 30分間水で希釈した0.1％ポリリジンで0.5μmの直径のポリスチレンビーズ（前髪ラボ）をインキュベートすることにより、ポリリジンでコーティングされたビーズを加えます。その後、ビーズを3回洗浄し、水に懸濁します。 </li><li>セファレキシン（50μg/mL）を含むLBに2つの要因によってビーズ溶液を希釈し、そしてフローチャンバーにそれを追加します。 </li><li>光学的にフローティングビーズをトラップし、細胞の自由な先端に触れる。 （我々は、サンプルの動きを制御するマッドシティLabsのピエゾステージを使用する。）適当なセル/ビーズの組み合わせが見つかると、アタッチされていないビーズを除去するLBのセファレキシン（50μg/mL）でチャンバーを洗浄する。 </li><li>セルと記録力 - 変位のデータに曲げ力を適用するためにカスタムで作成されたLabVIEWプログラムを実行します。プログラムの詳細<ol class="lalpha"><li>ラスタが検出レーザービームと記録3D PSDの電圧信号内に添付されたビーズを走査することにより、検出器の応答を較正します。 </li><li>顕微鏡画像の細胞長軸を識別します。 </li><li>細胞長軸に垂直な方向のステップでセルを移動します。 </li><li>光トラップからの距離を移動し、変位を記録。 </li><li>以前に測定されたトラップの剛性を使用して加えられる力に変位に変換し、ファイルへの先端の変位と力を保存します。 </li></ol></li></ol>成功の秘訣：ステップ8で）、一つは、明確に定義されたスタックの端でセルを見つける必要があります。いくつかのセルは、一つの先端で立ち往生、および他の先端の曲げ力は、旋回ではなく、曲げ細胞全体につながるされています。適切なペアは、ジョイスティック制御の段階の動きを使って手作業で迅速に各セルを曲げることにより求められる。 代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="図1"> 図1この図は、単一のセルのための力-変位のデータを示しています。この直線の傾きは、セルの曲げ剛性である。

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

この記事のビデオ制作は、これらの研究で使用される楽器を作り出すマッドシティ研究所後援した。

ここで紹介するプロトコールは、定量的に細菌細胞の曲げ特性を測定するために設計されています。実験のセットアップはfilamentously成長させることができる任意の棒状体細胞に適用することができます。我々は成功したE.の曲げ剛性の細胞骨格フィラメントの影響を調べるためにこの設定を使用している大腸菌細胞。この同じ手法は、細胞の全体的な曲げ剛性を決定する際の圧力、細胞壁の剛性と他の細胞内成分の役割を評価するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>セファレキシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>ポリリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0.5-&amp;mu;m径ポリスチレンビーズ</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Nano-LPシリーズ ナノポジショニングシステム</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

我々は、糸状棒状の細菌の曲げ剛性を測定するためのプロトコルを開発した。力は光トラップ、高強度レーザービームを顕微鏡の対物レンズによって非常に小さなスポットに焦点を当てているときに形成される光で作られた微細な三次元の春に適用されます。セルを曲げることは、まず化学的に処理されたカバースリップに生菌をバインドします。これらの細胞が成長するにつれ、細胞の真ん中には、カバースリップに結合したままですが、成長末端はこの拘束は無料です。薬セファレキシンと糸状成長を誘導することによって、我々は、もう一方の端がアタッチされていないと曲げ力の影響を受けやすいままであったセルの一端が表面に付着された細胞を同定することができます。曲げ力は、増殖細胞の先端にポリリジンでコーティングされたビーズを結合することによって、光学トラップで適用されます。力とビーズの変位の両方を記録し、細胞の曲げ剛性は、この関係の傾きであるされています。

我々は細胞の曲げ剛性を測定するために光トラップを使用して、カバースリップの表面に付着する糸状菌細胞を曲げるためのプロトコルを提示する。

私たちは、糸状の桿状細菌の曲げ剛性を測定するためのプロトコルを開発しました。光ピンセット（光学トラップ）を用いて力を加え、顕微鏡下で...

個々の coli 細胞の曲げ剛性を決定するために、まず細菌を対数増殖期まで培養し、化学処理を施したカバースリップ表面に付着させます。表面に付着した細胞をさらに増殖させ、柔軟な末端を発達させます。次に、誘電体ビーズを流し込み、ビーズをトラップして、細胞の柔軟な先端に向けて曲げます。手順の最終ステップは、光トラップを用いて細胞を曲げ、得られた強制変位データを測定することです。細胞の曲げ剛性は、強制変位データに線形フィッティングを行うことで算出できます。こんにちは、私はプリンストン大学のルイス・シクラー統合ゲノミクス研究所および物理学部のJoshua Shere教授の研究室に所属しているSteven Wongです。本日は、個々のE. coli細胞を曲げ、細胞の剛性を測定する方法を実演します。当研究室ではこの手法を用いて、細菌細胞の機械的完全性に対するさまざまな細胞内構造の寄与を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、任意のE. coli細胞3 mLをLB培地中で対数増殖期まで培養します。細胞の600 nmにおける吸光度が0.2から0.4に達したら、50 µg/mLのセファレキシンを培養液に添加し、15分間インキュベートして糸状成長を誘導します。この15分間に、フローチャンバーを作成します。2本の両面テープを、テープ間に3 mmの隙間をあけてガラススライドに貼り付け、その上にカバーガラスをテープで固定します。テープ間の隙間が液体を流すためのチャネルとなります。マイクロピペットを用いて、水で希釈した1% polyethaline 10 µLをフローチャンバー内に流し、5分間インキュベートしてカバーガラスをPEIでコーティングします。次に、チャンバーの一端から200 µLの水を流し込み、もう一端から真空吸引することで洗浄します。セファレキシン存在下で細菌を15分間培養した後、1 mLの細胞をマイクロ遠心機で遠心分離し、セファレキシンを含む200 µLのLVで再懸濁します。続いて、再びマイクロピペットを一方の端に、真空吸引をもう一方の端に用い、濃縮した細胞培養液50 µLをコーティング済みカバーガラスが入ったチャンバー内に流し込み、3分間インキュベートします。次に、セファレキシンを添加した50 µLのVel Bで洗浄します。未接着細胞を除去するため、光学トラッピング装置にセットするまでの間、チャンバーを37 °Cで30分から1時間インキュベートし、接着細胞を増殖させます。0.1% Polylysineを水で希釈した液中で、直径0.5 µmのポリスチレンビーズ3 µLを30分間インキュベートし、ポリリシンコートビーズを調製します。ビーズのインキュベーションが完了したら、マイクロ遠心機でスピンダウンし、1 mLの水で再懸濁させる洗浄操作を3回行います。その後、ビーズを細菌に結合させ、細胞の結合剛性を測定します。本プロトコルで最も困難な点は、曲げ剛性の測定に適した良好な細胞を探索し、特定し、認識することです。良好な細胞とは、固定端と自由端が明確に定義されている細胞のことを指します。顕微鏡上のフローチャンバー内で、端部が明確に固定されている細胞を探します。細胞によっては一方の先端のみが付着しており、もう一方の先端に曲げ力が加わると、細胞が曲がるのではなく細胞全体が回転してしまう場合があります。適切な細胞を見つけるには、ジョイスティックで制御されるステージ移動を用い、トラップで各細胞を素早く曲げて確認してください。適切な細胞が見つかったら、ビーズ溶液をセファレキシン含有LB培地で2倍に希釈し、フローチャンバーの一端からピペッティングで30 µLのビーズ溶液を加え、もう一端からKimwipeで緩やかに流し出します。浮遊しているビーズを光トラップで捕捉し、細胞の自由端に接触させます。さらに、50 µLのセファレキシン含有LB培地を用いてマイクロピペットとKimwipeでチャンバー内を洗浄し、付着していないビーズを除去します。次に、独自に作成したLabVIEWプログラムを実行して細胞に曲げ力を加え、強制変位データを記録します。まず、検出レーザービーム内で付着したビーズをRAスキャンし、3D PSD電圧信号を記録することで、検出器の応答を校正します。次に、顕微鏡画像を用いて細胞の長軸を特定します。細胞の長軸を特定した後、長軸に垂直な方向へ細胞を段階的に移動させながら、移動距離と光トラップの中心からのビーズの変位を記録します。最後に、あらかじめ測定したトラップ剛性を用いて変位値を印加力に変換し、保存します。ここでファイルに保存されるチップの変位と力は、単一細胞の強制変位データとなります。この直線の傾きが、細胞の曲げ剛性になります。以上で、E. coliの曲げ剛性を光学トラップに組み合わせる方法を説明しました。この手順を行う際は、固定端と自由端が明確に定義された良好な細胞を見つけることが重要です。これで完了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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