光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定
April 26th, 2010
我々は細胞の曲げ剛性を測定するために光トラップを使用して、カバースリップの表面に付着する糸状菌細胞を曲げるためのプロトコルを提示する。
個々の大腸菌細胞の曲げ剛性を決定するには、まず細菌を指数関数的に増殖させ、次に化学的に処理されたカバースリップ面にそれらを付着させます。すでに表面に付着している細胞をさらに成長させて、柔軟な末端を発達させます。次に誘電体ビーズを流し、ビーズをトラップしてセルの柔軟な先端に曲げます。
手順の最後のステップは、光学トラップでセルを曲げ、結果として得られる強制変位データを測定することです。セルの曲げ剛性は、強制変位データへの線形フィットによって計算できます。こんにちは、Louis Sickler Institute of Integrative Genomicsおよびプリンストン大学物理学部のJoshua Shere教授の研究室のSteven Wongです。
今日は、個々のエコセルを曲げる手順と、その結合セルの硬さをお見せします。私たちの研究室では、この手順を使用して、細菌細胞の機械的完全性に対するさまざまな細胞内構造の寄与を研究しています。それでは始めましょう。
この手順を開始するには、LB培地から指数関数的相まで任意の大腸菌細胞を3ミリリットル増殖させます。細胞が0.2〜0.4の600ナノメートルの光学密度に達したら、培養物に50マイクログラム/ミリリットルのセファレキシンを15分間補給して、糸状成長を誘導します。この15分間で、フローチャンバーを作ります。
スライドガラスに3mmの隙間を空けた両面テープを2枚貼り、その上にカバースリップをテープで貼り付けます。テープとテープの隙間は、液体を流すためのチャネルを形成します。マイクロピペットインキュベートで5分間インキュベートし、水で希釈した10マイクロリットルの1%ポリエタリンをフローチャンバーに流して、カバースリップをPEIでコーティングします。
次に、チャンバーの一方の端に200マイクロリットルの水を流し、もう一方の端に真空で集めて洗浄します。セファレキシンの存在下で細菌を増殖させてから15分後、マイクロ遠心分離機で1ミリリットルの細胞をスピンダウンし、セファレキシンを含む200マイクロリットルのLVに再懸濁します。次に、再び、一方の端にマイクロピペットを使用し、もう一方の端に真空を使用して、コーティングされたカバースリップを保持しているチャンバーに50マイクロリットルの濃縮細胞培養を3分間インキュベートします。
次に、セファレキシンを添加した50マイクロリットルのVel Bで洗います。未付着の細胞を除去するには、チャンバーを摂氏37度で30分から1時間インキュベートして、付着した細胞を成長させてから、細胞をインキュベートしながら光学トラップ装置に置きます。直径0.5μmのポリスチレンビーズ3マイクロリットルを、水で30分間希釈した0.1%Polylysineのいずれかにインキュベートすることにより、ポリリジンコーティングビーズを調製します。
ビーズのインキュベーションが終わったら、微量遠心分離機でスピンダウンして3回洗浄し、1ミリリットルの水に懸濁して蘇生し、ビーズをバクテリアに結合させ、細胞の結合剛性を測定します。このプロトコルの最も難しい側面は、曲げ、剛性の測定に適したセルを検出、位置特定、および認識できることです。そして、良いセルとは、明確に定義されたスタックエンドとフリーエンドの配置を持つセルです。
顕微鏡のフローチャンバーは、端が明確に固着した細胞を探します。一部のセルは一方の先端だけに取り付けられており、もう一方の先端の曲げ力により、セル全体が曲がるのではなく回転します。適切なセルを見つけるには、ジョイスティック制御のステージモーションを使用して、トラップで各セルをすばやく曲げます。
適切な細胞が見つかったら、ビーズ溶液をセファレキシンで2倍にlbに希釈し、一方の端にピペッティングし、もう一方の端でキムワイプ組織で静かに流れ出すことにより、30マイクロリットルのビーズ溶液をフローチャンバーに加えますフローティングビーズを光学的にトラップし、細胞の自由な先端に接触します。マイクロピペットでチャンバーを再度洗浄し、LBに50マイクロリットルのセファレキシンを入れたKimホワイトティッシュを使用して、付着していないビーズを取り除きます。次に、カスタムのラボビュープログラムを実行して、セルに曲げ力を適用し、強制変位データを記録します。
まず、検出レーザービーム内に取り付けられたビーズをRAスキャンし、3D PSD電圧信号を記録することにより、検出器の応答を較正します。次に、顕微鏡画像で細胞の長軸を特定します。長尺セル軸を特定した後、セルレコードを移動させながらセルを長軸に垂直な方向に段階的に移動させ、移動距離と光トラップの中心からのビーズの変位を
合わせる。最後に、以前に測定したトラップ剛性を使用して変位値を適用力に変換し、保存します。ここでの先端変位とファイルへの強制は、1 つのセルの強制変位データです。この線の傾きは、セルの曲げ剛性です。
大腸菌の曲げ剛性と光学トラップを組み合わせる方法を紹介しました。この手順を使用するときは、明確に定義されたスタックエンドとフリーエンドを持つ適切なセルを見つけることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、光学トラップ技術を用いてフィラメント状の細菌細胞の曲げ剛性を測定するためのプロトコルを紹介します。この方法は、E. coli 細胞を培養し、それらをカバレラスリップに接着させ、曲げ力を加えて機械的特性を評価することを含みます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 生物物理学
- 細胞力学
背景
- 細菌細胞の機械的特性を理解することは、それらの挙動と完全性に関する洞察を得るために重要です。
- E. coli のフィラメント状の成長を誘導して、その曲げ剛性を研究することができます。
- 光学トラップは、個々の細胞に力をかける非侵襲的な方法を提供します。
- これまでの研究は、様々な条件下での細胞の機械的完全性に焦点を当てています。
研究の目的
- E. coli 細胞の曲げ剛性を測定するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 細胞力学への細胞内構造の寄与を調査すること。
- 機械的ストレス下での細菌細胞の挙動の理解を深めること。
使用した方法
- LB培地中でE. coli 細胞を指数相に培養する。
- セファレキシンを使用してフィラメント状の成長を誘導する。
- 化学的に処理されたカバレラスリップに細胞を接着させる。
- 光学トラップを使用して曲げ力を加えて変位データを測定する。
主な結果
- このプロトコルは個々のE. coli 細胞の曲げ剛性を正確に測定することができます。
- データ分析により、加えられた力と細胞の変位の関係が明らかになりました。
- 測定に適した細胞を特定することが正確な結果を得るために重要です。
- この発見は細菌細胞力学の理解に貢献します。
結論
- 開発されたプロトコルは、細菌細胞の機械的特性を研究するのに効果的です。
- 光学トラップは細胞の剛性を調査するための貴重なツールです。
- 将来の研究では、これらの発見を基に細胞力学の他の側面を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
