コロニー形成単位(CFU)の計数:ハエの体からの細菌の定量(英語)

- まず、開発の望ましい段階でハエを収集し、滅菌チューブに入れます。内部の微生物叢のみを数えるには、ハエを70%エタノールに浸してハエの外側を滅菌します。内部と外部の両方の微生物叢を測定するには、この滅菌ステップをスキップします。次に、セラミックビーズと組織ホモジナイザーを使用して、または乳棒を使用して、少量の細菌増殖培地でハエを粉砕します。外部からの細菌を持ち込まないように注意し、試料の混入を防ぐ必要があります。

これで、培養できるバクテリアを含む均質な混合物ができました。液体細菌培地を使用してホモジネートの量を上げます。ホモジネートの段階希釈を行い、これらの希釈液をバクテリアに適した固体増殖培地に一定量プレートします。バクテリアが成長すると、プレート上にコロニーが形成されます。10〜100コロニーの範囲の希釈液を見つけて、サンプルのコロニー形成単位(CFU)を決定します。

プロトコル例では、無菌のハエにgnotobioticまたは定義された細菌培養物を接種し、CFUを収集して測定します。

- フィルターチップを使用して、100マイクロリットルの一晩成長を滅菌マイクロフュージチューブに移します。次に、各培養物の200マイクロリットルを96ウェルプレートに移します。バイオセーフティキャビネットからサンプルを取り出し、遠心分離機でバクテリアをペレット化します。1倍、2倍、4倍に希釈した後、マルチウェルプレート読み取り分光光度計で光学濃度またはOD600を測定します。

OD600を入手した後、ピペットチップで上清を取り除き、新しいmMRSを使用してペレットを再懸濁します。希釈した細菌株を等比率で混合して、多種カクテルを作成します。50マイクロリットルのカクテルを、無菌食とデコレーション卵が入った円錐形のチューブに移します。バイアル間の汚染を防ぐために、卵子の移植後に必ず細菌を追加してください。次に、接種したチューブをインキュベーターに入れます。

コロニー形成ユニット(CFU)を測定するには、125マイクロリットルのセラミックビーズと125マイクロリットルのmMRSブロスを含む1.7ミリリットルのマイクロフュージチューブに5匹のハエを移します。組織ホモジナイザーを使用してハエを均質化します。フライが残っているピース全体はないはずです。次に、ホモジネートを875マイクロリットルのmMRSで希釈し、ホモジネートを5秒間ボルテックスし、120マイクロリットルをマイクロタイタープレートの最初のウェルにピペットで移します。

第1のウェルから10マイクロリットルを取り出し、70マイクロリットルのMRSが入った第2のウェルに加えます。次に、2番目のウェルから70マイクロリットルのMRSを含む3番目のウェルに10マイクロリットルを移し、十分に混合します。各希釈液の10マイクロリットルをmMRSプレートに移します。皿を少し傾けて、希釈液を寒天の表面に数ミリメートル広げ、液体を乾かしてからプレートを動かします。個別の個々のコロニーが見えたら、インキュベーターからプレートを取り出し、10〜100個の分離コロニーで希釈してカウントします。最後に、フライあたりのCFUを計算します。