0 閲覧数 • 2:56 分 • April 30th, 2023
- 洗浄したC.エレガンスを液体で、線虫のキューティクルがガラス表面にくっつくのを助ける化合物であるポリリジンでコーティングされたスライドガラスに移します。別のスライドガラスをそっとまっすぐ押し下げ、端が下部のスライドに張り出します。ワームを損傷せずに固定するには、横方向の動きを避けて動物を圧縮します。次に、液体窒素やドライアイスなどの凍結剤で満たされた断熱実験室容器内の金属ブロックに、ワームを挟んだスライドガラスを置きます。
金属は効果的な温度伝導体であり、ブロック表面が十分に冷たく、ワームのキューティクルを両方のガラス表面に急速に凍結させます。凍結したら、スライドガラスをすばやく分離して、ワームのキューティクルを引き離すか、割れて開きます。低透過性のキューティクルが破壊されると、化学固定剤と染色抗体が内部の線虫組織にアクセスできるようになるため、組織の固定と染色を進めます。次のプロトコルでは、凍結分解技術と組織固定の詳細なデモンストレーションを見ていきます。
- まず、ワームを固定するためのスライドを用意します。30マイクロリットルのポリ-L-リジンをスライドにピペットで移し、次に、2番目のスライドをもう一方のスライドにセットし、それらをこすり合わせて溶液を両方に均等に広げます。次に、2つのスライドをはがし、30分間自然乾燥させます。
次に、液体窒素で満たされた容器に平らな金属ブロックを置きます。プレートをM9溶液で洗浄し、ワームを含む約10マイクロリットルのM9を移します。または、ワームを選択し、スライドにM9を追加します。
ワームが移動したら、カバースリップが一方の端に張り出すように、カバースリップを横方向にそっと落とします。次に、横方向に動かさずにカバースリップをそっと押します。
次に、すぐにスライドを液体窒素の金属ブロックに移し、凍結させます。5分後、張り出した端を使用してカバースリップをはじき取ります。キューティクルの適切な亀裂を得るために、これを迅速に行ってください。
次に、スライドをメタノールを充填したガラス製のCoplinジャーにマイナス20°Cで浸します。5分後、スライドをアセトンを充填したガラス製のCoplinジャーに同じ温度でさらに5分間移します。スライドは直接染色することも、マイナス20°Cで保存することもできます。