シングルワームPCR:ゲノムDNAを抽出し増幅する方法

- 単一線虫PCR解析では、雌雄同体の線虫が自家受精して卵を産むと、遺伝的に同一の子孫を産むため、改変株のコピーを保存します。次に、親を線虫溶解バッファーの入ったチューブに移します。

チューブをマイナス80°Cで凍結して、キューティクルまたは外層を壊します。サンプルを摂氏プラス60度に加熱して線虫細胞を溶解し、細胞内タンパク質と細胞のゲノムDNAを放出します。この温度では、バッファー内のプロテイナーゼKがタンパク質、特にゲノムDNAを破壊するヌクレアーゼを分解します。

次に、温度を摂氏95度に上げて酵素を不活性化します。最後に、反応バッファー、dNTP、目的領域のフォワードプライマーとリバースプライマー、taqポリメラーゼ、および水で構成されるPCRマスターミックスをチューブに細胞ライセートを加え、反応を所望の最終容量にします。PCRを実行するには、目的のDNA領域を増幅する適切なサーマルサイクラープログラムを実行します。

次の例では、単一のF1線虫のゲノムDNA中のCRISPR-Cas9編集イベントをスクリーニングするPCR手順を示します。

- 産卵の1〜2日後、ワームPICを使用して、F1を7マイクロリットルの温かい溶解バッファーを含む個々のPCRストリップチューブキャップに移します。PCRチューブを最大速度および室温で1分間遠心分離し、動物をチューブの底に持っていきます。次に、チューブを摂氏マイナス80度で1時間凍結します。

次に、次のプログラムを使用して、凍結した線虫をサーマルサイクラーで溶解します。次に、この表に示すようにPCRマスターミックスをセットアップします。

21マイクロリットルのPCRマスターミックスを清潔なPCRチューブに加えます。次に、4マイクロリットルの線虫溶解チューブを加え、ピペッティングでよく混合します。

次に、メーカーのガイドラインに従ってPCRプログラムを実行します。