線虫のシングルセル解離:生細胞を単離する方法

0 閲覧数4:51 • April 30th, 2023

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- 洗浄したペレット状のワームから始めて、SDS、界面活性剤、および還元剤であるDTTを含む溶解緩衝液を添加します。これにより、線虫の保護キューティクルが分解され、細胞解離のために体が露出します。細胞の溶解と死を最小限に抑えるために、溶解バッファーへの長時間の曝露を避けてください。

次に、低温分離バッファーを数回洗浄して溶解試薬を取り出します。細胞死を防ぐためには、このバッファーが正しい浸透圧であることが重要です。プロテアーゼ酵素を使用して、細胞間の結合を分解します。混合液をチューブ壁に対してピペッティングすることにより、機械的エネルギーとともに均質化プロセスを支援します。

酵素反応を止めるための血清と汚染を防ぐための抗生物質を含む培地を追加します。サンプルを数回ペレット化して洗浄し、ほとんどの破片を取り除きます。

最後に、チューブを氷の上に置いて、重力沈殿を可能にします。キューティクルの残骸や細胞塊などの破片は沈降しますが、解離した細胞は培地の最上層に懸濁したままになります。これらの細胞は、短期培養に使用したり、FACSや免疫沈降法による特定の細胞集団の単離に使用することができます。

このプロトコル例では、目的のニューロンでGFPを発現するトランスジェニック線虫を解離し、それらの細胞を単離して分析します。

- 動物を採取した後、1,600gで5分間遠心分離します。すべての上清を取り除き、1ミリリットルのM9メディアにワームを再懸濁します。懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

1,600 g で 5 分間遠心分離し、線虫をペレット化します。次に、200マイクロリットルのSDS-DDTバッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。ワームは、光学顕微鏡で見ると、体に沿ってしわが寄っているように見えるはずです。

次に、800マイクロリットルの氷冷分離バッファーを追加し、チューブを静かにフリックして混合します。13,000 g、摂氏4度で1分間遠心分離し、線虫をペレット化します。上清を取り除き、1ミリリットルのアイソレーションバッファーで洗浄します。

この遠心分離と洗浄のプロセスを合計5回繰り返し、そのたびにアイソレーションバッファーを慎重に除去するようにしてください。この後、分離バッファーに溶解したStreptomyces griseus由来のプロテアーゼ混合物100マイクロリットルをペレットに加えます。

室温で10〜15分間インキュベートします。200マイクロリットルのマイクロピペットチップをチューブの底に当てて60〜70回ピペッティングして、機械的な混乱を必ず適用してください。消化の段階を決定するには、消化混合物の1〜5マイクロリットルを取り出し、スライドガラス上に落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。

5〜7分後、線虫の断片は目に見えて縮小したキューティクルを持ち、細胞のスラリーが容易に見えるようになります。10%FBSとペニシリン-ストレプトマイシンを補充した市販のLeibovitzのL15培地900マイクロリットルを追加して反応を停止します。

10,000 g、摂氏4度で5分間遠心分離し、単離されたフラグメントと細胞をペレット化します。ペレット化した細胞を、1回の洗浄につき1ミリリットルの培地を使用して、冷たいL15添加培地でさらに2回洗浄します。ペレット化した細胞を1ミリリットルのL15添加培地に再懸濁し、氷上に30分間放置します。

次に、約700〜800マイクロリットルの最上層を取り、それを微量遠心チューブに移します。自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して、単離された細胞の10〜25マイクロリットルの細胞密度を測定します。

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最終更新:1 8月 2026