遊泳誘発性麻痺(SWIP)アッセイ:C.エレガンスにおけるドーパミン媒介性運動を定量化する方法

- 遊泳誘発性麻痺、またはSWIPアッセイを実行するには、L4段階のC.エレガンスの幼虫を液体で満たされたガラススポットプレートに移します。L4雌雄同体は、発達中の外陰部の存在によって識別されます。胴体の中点に半月形の斑点があり、鞭のような尻尾がついている。

ドーパミンを介した水泳を評価するには、C字型の体の曲げとスラッシングの行動を特徴とするワームの動きを記録します。通常、ドーパミン作動性ニューロンはドーパミンをシナプス間隙に放出し、シナプス間隙は受容細胞のドーパミン受容体に結合します。

メッセージが伝えられると、ドーパミンが受容体から放出され、結合していない神経伝達物質は、特殊なトランスポータータンパク質を介してドーパミン作動性ニューロンに取り込まれ、再利用することができます。

ドーパミントランスポーターの不活性化変異またはドーパミン放出を増加させる薬物治療によって引き起こされるドーパミンシグナル伝達の変化した幼虫では、ドーパミンはシナプス間隙に蓄積します。過剰なドーパミンはドーパミン受容体を刺激し、運動プログラムを妨害し、幼虫を麻痺させます。動けなくなった幼虫はプレートの底に沈みます。

このプロトコル例では、アンフェタミンで処理したC.エレガンスにおける手動および自動のSWIPアッセイの詳細なデモンストレーションを見ていきます。

- SWIPの手動評価のために、0.5ミリモルアンフェタミンの有無にかかわらず、ガラススポットプレートに40マイクロリットルの制御溶液を追加します。ステレオスコープの下で、まつげピックで8〜10匹の後期L4ステージワームを選び、ワームがピックから離れて溶液に泳ぐまで、溶液を含むウェルにピックを沈めます。

タイマーを開始します。ウェルに放出されたワームの数に注意し、各分マークでSWIPを示すワームの数を合計10分間観察して記録します。

手順の最後に、生データをスプレッドシートにコピーし、毎分麻痺した線虫の数をアッセイ全体でテストした線虫の総数で割り、100を掛けて麻痺した線虫の割合を計算します。パーセント値を任意のグラフ作成および統計ソフトウェアにコピーし、XYグラフ形式を使用して、Y軸にSWIPのパーセント値、X軸に時間を使用してデータをプロットします。

対照群とアンフェタミン処理群、治療時期の統計解析ができる。たとえば、二元配置分散分析と事後分析を使用します。

遊泳誘発性麻痺の自動分析を行うには、カメラ、ワームトラッカーソフトウェア、および追跡ソフトウェア分析を実行するためのスクリプトを設定します。また、前に示すように、まつげピックを使用して、後期のL4ワームを1つガラススポットプレートに配置します。

次に、一度に1つのワームの水泳ビデオを録画し、ワームトラッカーソフトウェアを使用して体の曲げの頻度を計算します。トラッキングソフトウェアに付属のスクリプトに従って、ワームスラッシングの頻度を取得し、ワームスラッシングデータからヒートマップを生成します。