C. elegans摂食のためのRNAiプレーティング:大腸菌における標的dsRNA発現を誘導する技術

- C.エレガンスでは、組換えDNAプラスミドから二本鎖RNAまたはdsRNAを発現する細菌をワームに給餌することにより、RNAiを誘導できます。

まず、テトラサイクリンとアンピシリン、またはその機能的類似体カルベニシリンを含む選択的LB寒天プレート上で、L4440プラスミドをトランスフェクトしたテトラサイクリン耐性HT115大腸菌を一晩増殖させます。標的DNAに加えて、プラスミドにはアンピシリン耐性の遺伝子が含まれています。プラスミドを継承する細菌コロニーのみが、これらの抗生物質の存在下で増殖することができます。

次に、バクテリアコロニーを採取し、液体LB培地で目的の濃度に拡大します。dsRNA発現を誘導するには、IPTGを含む調製した線虫増殖培地(NGM)寒天プレートに細菌溶液を移します。

この発現系では、IPTGはラクトースを模倣してlacリプレッサーを不活性化し、T7 RNAポリメラーゼの発現を可能にします。プラスミド上では、標的DNAの発現は2つの収束性T7プロモーターによって調節されています。その結果、センス配列とアンチセンス配列が転写され、dsRNAの発現につながります。

最後に、線虫は、摂取したdsRNAからの配列情報を使用して、相補的な配列を持つ内因性mRNAをダウンレギュレーションします。この実験では、線虫の摂食用にトランスジェニック大腸菌を用いたRNAiプレートを調製します。

- RNAiプレートの場合、IPTGおよびカルベニシリンを含むNGM寒天を6cmプレートにロードします。暗所で室温で24〜48時間乾燥させます。次に、それらを摂氏4度に最大14日間移します。

次に、カルベニシリンとテトラサイクリンを含む線条選択プレートに、lin-53遺伝子を運ぶL4440プラスミドを持つRNAi細菌クローンを作製します。三相ストリーキングパターンを使用し、空のベクトルコントロールを必ずプレートしてください。次に、プレートを摂氏37度で一晩成長させます。

翌日、少なくとも3つの単一コロニーを選び、それぞれを別々の培養チューブに接種し、テトラサイクリンではなくカルベニシリンを補充した2ミリリットルのLBを投与します。条件ごとに3つの健康な培養物を持つことを計画します。

次に、培養物を摂氏37度で一晩成長させ、600ナノメートルで0.6〜0.8の光学密度に達するまで成長させます。次に、各細菌培養物500マイクロリットルを6cmのNGM寒天RNAiプレートに加えます。プレートを室温で暗所で一晩インキュベートします。