4ウェイ嗅覚計アッセイ:ショウジョウバエの匂い物質手がかり反応を評価する方法

- 4方向嗅覚計は、各コーナーに一方向ポートを備えた密閉チャンバーで、最大4つの臭気を送達でき、異なる臭気プロファイルを持つ象限を作成します。覚醒しているハエをチャンバーに移すことから実験を開始します。麻酔は実験中の行動に影響を与える可能性があるため、避けてください。

ハエをきれいな空気にさらし、その動きを観察して、臭気物質が嗅覚計を汚染し、ハエの行動に影響を与えていないことを確認します。次に、試験臭気物質を別々のバイアルに調製し、一方向ポートを介してメインチャンバーに接続します。ハエをあらかじめ決められた期間臭気物質にさらし、試験終了後に刺激を取り除きます。

ハエは、忌避臭のある象限を避けながら、魅力的な臭いのある象限に向かって移動し、そこに落ち着く傾向があります。ハエの匂いを原因とする行動反応を測定するには、嗅覚計を探索する際の位置を経時的に追跡します。

次のプロトコルでは、空気送達システムを備えた4象限嗅覚計を使用して、忌避臭剤であるプロピオン酸エチルと魅力的なアップルサイダービネガーに反応したハエの行動を分析します。

- 少なくとも5分前に、温度コントローラーのスイッチを入れ、摂氏25度に設定します。次に、臭気チャンバーをプラスチックチューブを介してアリーナに接続します。電子流量計を使用して、アリーナの各象限の空気流量を確認します。制御と臭気と空気の流れの両方が毎分100ミリリットルで流れていることを確認してください。

- ハエは気流に非常に敏感であり、各実験の前に各象限の気流を確認することが重要です。

- 次に、70%エタノールを使用してアリーナとガラスプレートを清掃します。すべての部品を2〜3回拭き取り、完全に風乾させてから進めます。次に、ガラス板をアリーナに固定します。次に、麻酔なしでハエをアリーナに移します。重力を使用して、ガラス板の1つの穴から入り、穴を円形のメッシュで覆います。

次に、フライロードされたアリーナを光密チャンバーに配置します。次に、4つのコントロールエアストリームを各アリーナコーナーに接続します。チャンバーのドアを閉め、ハエが新しい環境に10〜15分間順応するのを待ちます。

順応期間の後、ハエを4つの制御空気流にさらす5〜10分間の制御実験を実行します。ここで、データをすぐに分析することが不可欠です。ハエがアリーナに均等に分布していない場合は、アリーナをリセットする必要があります。

- コントロールフライの挙動をきれいな空気だけにテストすることが重要です。これにより、すべてのバックグラウンド条件が正常であることがすぐに確認できます。光の漏れ、温度の不均衡、アリーナの傾き、または臭いの汚染はすべて問題を引き起こす可能性があります。

- 必要に応じて、フライを捨ててアリーナを再度清掃します。臭気物質の汚染が疑われる場合は、すべてのチューブを交換してください。動物が4つの象限のいずれにも選好を示さなくなるまで、新しいコホートで対照試験を繰り返し続けます。次に、三方弁を使用して試験臭気チャンバーをセットアップに接続するか、チューブを再度接続して5〜10分間試験実験を実行します。実験記録を長時間行う場合は、トラッキングプログラムを20分ごとに迅速に停止して再開しないと、データファイルが大きすぎます。

テストの合間に、ハエを捨て、アリーナとガラスプレートを70%エタノールで清掃し、コネクタチューブを交換します。乾燥した空気の流れを維持して、システムを継続的にフラッシュします。効率を上げるには、走行中に清掃ができるようにアリーナを2つ用意するとよいでしょう。

- 複数の実験を同じ日に行う場合は、前回の実験でシステムに臭いが残らないように細心の注意を払ってください。これは通常、低濃度の臭気物質やCO2では問題になりません。しかし、高濃度の刺激の場合、実験の実行間に最大24時間の間隔が必要になることがあります。