0 閲覧数 • 4:28 分 • April 30th, 2023
- Y迷路は、Y字型のコネクタと、3つのフライバイアルが直線または先細りのチューブで接続されているもので構成されています。ハエは、彼らが好む刺激で迷路を横に向かって移動します。実験を開始するには、揮発性化学物質を含む溶液を入れたティッシュペーパーを各バイアルに入れます。次に、それらをテーパーチューブに接続します。先細りのチューブは、ハエが迷路の中心に戻る能力を制限し、揮発性化学物質の拡散を遅らせます。
次に、飢えたハエを冷やして速度を落とします。化学麻酔はアッセイの結果に影響を与える可能性があるため、使用しないでください。冷やしたハエと一緒にバイアルを迷路の最終面にすばやく接続します。迷路を探索するためにハエを残してください。明るい光によって引き起こされる好みを減らすには、ハエが見ない遠赤光の下でこの手順を実行します。最後に、迷路の両側のハエを数えます。迷路内の彼らの位置は、その揮発性の化学物質の香りに対する彼らの好みを示しています。
プロトコルの例では、野生型のショウジョウバエを用いたY-mazeアッセイのセットアップを見ていきます。
- 翌朝アッセイを実施する前に、一日の終わりに、10〜20の実験ラインのコホートを、濡れたタオルから供給された水分でガラスバイアルに移します。ハエは16〜18時間以内にテストする必要があり、そうしないと乾燥や飢餓により死亡する可能性があります。翌日、Y迷路を組み立てます。まず、Y字型コネクタを2つのガラスバイアルに結合し、ピペットチップがトリミングされたフォームコネクタを使用してコンジットを作成します。それらの先細りの形状は、これらの一方通行の通路を作ります。
「Y」の3番目の枝は、ピペットチップの大部分から作られたローディングチューブに取り付けられており、ローディングバイアルから迷路の選択ポイントへの通過を可能にします。各先細りのトンネルの向こうにはガラスの小瓶があり、そのうちの1つに臭気物質を充填する必要があります。これらを40マイクロリットルのボーラスとして28ミリメートル四方のティッシュペーパーに浸します。2つのうちどちらに臭気物質が含まれているかは、ランダムに交互にする必要があります。
テストを行うには、まずハエを氷の上で短時間冷却して、ハエの速度を落とします。これは、LED電球からの遠赤色光の下で、摂氏25度である必要があります。ハエのコホートをローディングバイアルにそっと落とし、テストフライをY迷路にロードします。ガス麻酔は使用しないでください。
- ハエをローディングバイアルに迅速かつ穏やかに移すことは非常に重要です。これは、ハエがY字迷路で臭いが拡散する前に急速に目を覚まさなければならないため、実際にはこの実験の最も難しいステップです。
- ハエは24時間迷路を探索することを許可されるべきであり、そうすれば最大数のハエがどちらか一方のガラス瓶に移動する。異なるチューブに存在するハエの数は、嗅覚指数を計算するのに役立ちます。この値には、最大10匹のハエの行動から収集された標準的な統計手法を適用する必要があります。
10 フライ コホートで一貫した結果が得られない場合は、20 フライ コホートで試験を実施できます。迷路のコンポーネントをクリーンアップするには、それらを分解してRBS 35 MDに一晩浸します。その後、水道水ですすぎ、最後にDI水ですすぎてから自然乾燥させます。