C.エレガンス走化性アッセイ:線虫の化学感覚を試験する方法

- 遭遇した条件を理解し、それに応じて対応するために、線虫C.エレガンスは、とりわけ、さまざまな化学物質を検出できる高度に発達した化学感覚システムを持っています。

頭部の感覚ニューロン、両性唇ニューロン、内唇ニューロン、尾部のニューロン、ファスミドニューロンは、キューティクルを通じて直接的または間接的に外部条件にさらされます。これらの化学感覚ニューロンは、線虫が適切な行動反応(走化性と呼ばれる行動)を生み出すために使用する関連情報をコード化しています。

揮発性の臭気物質または味覚性の水溶性手がかりに対する走化性反応をテストするには、目的の発達段階の線虫を分離し、事前に準備した実験アリーナで試験化学物質にさらします。細菌の食物源によって生成されるような好ましい化学物質にさらされると、C.エレガンスは供給源に対して正の走化性を示します。

逆に、重金属のような好ましくない化学物質や有毒な化学物質にさらされると、線虫は負の走化性を示し、化学物質を避けます。したがって、嗅覚変異体または味覚変異体は、嫌悪性化学物質を避けることができず、嫌悪状態を避ける野生型の動物とは対照的に、好ましくない条件に留まります。

プロトコルの例では、線虫の銅に対する嫌悪感をテストする走化性アッセイのデモンストレーションを見ていきます。

- 一晩インキュベートした後、インキュベーターからプレートを取り出し、プレートのマークされた下側をガイドとして使用して、新たに調製した0.5モル銅2硫酸塩溶液の100マイクロリットルを寒天の端にピペットで注入し、外側の銅バリアを作成します。ピペットで25マイクロリットルの銅2硫酸塩溶液をピペットで固定し、正中線バリアを作成します。

銅2硫酸塩溶液が細菌パッチに接触しないようにし、銅溶液をプレート上で乾燥させます。移し替え後5分ごとに実験用ティッシュで、プレートの端付近に溶液を軽くたたいて乾燥を確認します。

アッセイの直前に、実験体を無菌寒天プレートに移し、線虫を1分間自由に動かして余分な細菌を除去します。

次に、24時間前に移植された若年成人のプレートに1ミリリットルのM9をピペットで移し、線虫を微量遠心チューブに洗浄します。線虫を3,000gで1分間遠心分離します。

ワームはチューブの底にペレットを形成する必要があります。ウォームペレットを乱さずにM9溶液を吸引します。1ミリリットルのM9溶液をワームペレットに加えます。チューブを反転させて、ワームを溶液と混合します。

過剰な細菌が最初に線虫と一緒に移された場合は、合計5回繰り返します。最終洗浄後、100マイクロリットルのM9溶液とワームペレットが残るまで上清を吸引します。洗浄手順が完了したら、すぐに溶液からワームを移します。

チューブの底から20マイクロリットルのワームペレットをアッセイプレートのバクテリアフリー半分にピペットで移します。10匹の線虫がアッセイプレートに移され、汚染された食品が存在しないことを確認します。バクテリアを銅製のフードレースプレートに移してはいけません。

分以内に実験用組織を用いて線虫から余分なM9溶液を除去する。M9溶液が銅2硫酸塩溶液に接触しないこと、およびワームと寒天の表面が無傷のままであることを確認してください。誤って実験室の組織で除去したワームを廃棄します。

M9溶液が除去され、すべての線虫が非液体の自発運動パターンを開始したら、つまり、線虫がスラッシングを停止したら、アッセイストップウォッチを開始します。誤って余分なワームが含まれていた場合は、ハロカーボンオイルで摘み取って取り除き、プレートにバクテリアが追加されないようにします。

アッセイプレートを30分ごとにチェックします。細菌パッチのあるアッセイプレートでは、生物が4時間以上にわたって食品パッチに到達した場合、生物に正のスコアを付けます。ネガティブコントロールプレートの場合、生物がバリアを通過した場合は、陽性のスコアを付けます。