表皮レーザー創傷:線虫の修復過程を調べるための局所的な損傷の誘発

- まず、若年成虫をスライド上の新しいアガロースパッドに移します。次に、12ミリモルのレバミゾール溶液を数滴加えて、ワームを麻痺させます。ワームをカバースリップで覆い、数分待ちます。スライドをスピニングディスク共焦点顕微鏡の下に置き、線虫の横方向の最も外側の表面に焦点を合わせます。

成虫の表皮は、細胞融合イベントから生じる多核合胞体からなる薄い単層構造です。表皮の頂端表面は柔軟なコラーゲン性クチクラを分泌し、基底表面は基底ラミナと呼ばれる細胞外マトリックスの薄い層で覆われています。

次に、表皮の頂端面をレーザーで傷つけます。損傷した細胞からの細胞質が漏れ出し、創傷部位に気泡として現れることがあります。

レーザー照射は、内部組織に損傷を与えることなく、キューティクルと表皮細胞の局所的な破壊を引き起こすため、針の傷などの他の技術よりも利点があります。プロトコルの例では、C.エレガンスにおけるレーザー創傷のプロセスを見ていきます。

- 線虫を正確に巻くために、このプロトコルはスピニングディスク共焦点顕微鏡に取り付けられたフェムト秒レーザーを使用します。また、2光子顕微鏡のようなフェムト秒レーザーを使用したラインスキャンやポイントスキャンでも十分です。

- 寒天パッドに10人の若者を集めることから始めます。2マイクロリットルの12ミリモルレバミゾール溶液でそれらを麻痺させます。次に、カバースリップで覆い、麻痺するまで数分待ちます。

- 動物が完全に麻痺していることが不可欠である。12ミリモルのレバミゾールは創傷反応に影響を与えない。ただし、他の固定化方法も使用できます。

- 対物レンズの前に測定したフェムト秒レーザー出力が140ミリワットに設定され、レーザーの繰り返し率が80メガヘルツであることを確認してください。次に、回転するディスク共焦点顕微鏡で線虫を見つけます。高い開口数を持つ100倍対物レンズを使用して、ターゲットワームの外側前部または後部合胞体表皮に焦点を合わせます。

表皮細胞の頂端面に焦点を合わせ、20ミリ秒間隔で200ミリ秒のパルスを2つ照射します。これは表皮を傷つけるのに十分なはずです。しばらく待って、細胞質の局所的な混乱を観察し、それが泡立って現れます。蛍光マーカーが存在する場合、局所的な漂白が観察されます。