JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 2:56 分 • April 30th, 2023
- C.エレガンスは、腸のバリアを破壊し、その透過性を高めることにより、部分的に病気を引き起こす腸内病原体による感染の実験モデルとして使用されます。目的の細菌または化合物に曝露した後のバリアインテグリティを定量化するには、ワームをプレートから洗い流して回収します。
次に、これらの線虫を寒天プレートに置き、加熱死菌と蛍光タグ付きの高分子量多糖であるFITC-デキストランを混合したラベル付き食品
を載せます。ワームがラベル付けされたバクテリアを食べるようにします。腸のバリアが無傷の人は急速に食物を排出しますが、透過性が高い腸を持つワームでは、蛍光マーカーは臓器の内腔を超えて浸透します。
ワームをホルムアルデヒド溶液に移して動物を固定します。1〜2分後、ホルムアルデヒドを封入剤と交換します。
最後に、蛍光顕微鏡で線虫を画像化します。C.エレガンスの腸内顆粒は自家蛍光性であるため、バックグラウンドシグナルが存在することに注意してください。しかし、全体としては、腸内蛍光が多いほど透過性が高いことを示しています。
プロトコル例では、病原性緑膿菌に感染した寄生虫の腸透過性に対する生体分子DIMによる治療の効果を分析します。
- 2ミリリットルの熱不活化大腸菌と4ミリグラムのFITCデキストランを混合して、FITCデキストランを補充したプレートを調製します。20枚の新鮮なNGM寒天プレートのそれぞれに100マイクロリットルの混合物を加え、プレートを清潔なラボベンチで1時間乾燥させます。48時間の治療後、Sバッファーでワームを洗浄します。それらをFITC-デキストラン添加プレートおよびFITCデキストランを含まないNGMプレートに移し、プレートを一晩インキュベートします。
翌日、寄生虫をS Bufferで洗浄し、新鮮なNGM寒天プレートを1時間這わせます。黒色の96ウェル平底プレートの各ウェルに50マイクロリットルの4%ホルムアルデヒドを加え、約50匹のワームを各ウェルに移します。1〜2分後、すべてのホルムアルデヒドを除去し、各ウェルに100マイクロリットルの封入剤を加えます。
- ホルムアルデヒドは有毒な化学物質であり、取り扱いには注意が必要です。