JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 3:39 分 • April 30th, 2023
- 溶媒であるDMSOを含む卵水にメトロニダゾールを溶解し、胚の色素形成を防ぐフェニルチオ尿素を添加します。適切な年齢のいくつかの幼虫を治療プレートとコントロールプレートに移します。.次に、所望の濃度のメトロニダゾール溶液を試験プレートに加え、DMSOを含む卵水をコントロールプレートに加えます。
両方のプレートの幼虫を摂氏28度で成長させます。トランスジェニック幼虫は肝細胞内でのみニトロレダクターゼを産生し、メトロニダゾールを細胞傷害性薬物に変換し、標的とした肝細胞のみを死に至らしめます。治療後、メトロニダゾール溶液を治療プレートから取り出し、胚を卵水で洗浄します。
幼虫に麻酔をかけるためにトリカインを追加し、重度の肝細胞アブレーション(肝細胞の破壊)のために落射蛍光顕微鏡でそれらを検査します。治療を受けた個人の肝臓は、対照群の個人よりもはるかに小さいことがわかります。プロトコル例では、トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生の肝細胞アブレーションにメトロニダゾールを使用して肝臓の再生を研究します。
- 最大100個の胚を25ミリリットルの卵水を含む100ミリメートルのシャーレに移し、皿を摂氏28度に置きます。色素沈着を抑制するには、受精後10時間以内でPTUを培養物に加えます。受精後80時間で、幼虫にトリカインを麻酔し、落射蛍光顕微鏡を使用してCFP陽性の幼虫を採取し、肝臓のサイズが同程度の動物のみを飼育します
次に、トリカインの卵水をPTUを補充した新鮮な卵の水に交換し、CFP陽性のゼブラフィッシュの幼生を摂氏28度のインキュベーターに戻します。ゼブラフィッシュの幼生をMTZで治療するには、まず、適切な数の幼生を2つの異なる培養容器に分割します。実験幼虫群を新たに調製したMTZの溶液に、対照群をDMSOを添加した卵水に保管します。
MTZの光不活性化を防ぐために実験グループをアルミホイルで覆い、ゼブラフィッシュの幼生の両方のグループを摂氏28度でインキュベートします。アブレーション期間の終わりに、プレートからMTZ溶液を取り出し、MTZ処理された溶岩を25ミリリットルの卵水で2〜3回洗浄し、渦巻き状に洗浄し、各洗浄後に卵水を廃棄します。最後の洗浄後、MTZで治療された幼虫の心臓浮腫と死亡を避けるために以前に使用したトリカインの半分の濃度で幼虫を固定します。.次に、落射蛍光顕微鏡でCFPフィルターを使用して、MTZ処理された溶岩の相対的な肝臓サイズに基づいて肝細胞のアブレーションレベルを評価します。幼虫の0%から5%を占める大きな肝臓を持つゼブラフィッシュを非切除するゼブラフィッシュ、中型の肝臓が幼虫の10%から20%を占めるゼブラフィッシュを部分的に切除するゼブラフィッシュ、幼虫の80%から90%を占める非常に小さな肝臓を持つゼブラフィッシュを完全に切除するゼブラフィッシュを考えてみましょう。