テールクリップからのDNA抽出:ゼブラフィッシュのジェノタイピングに用いる手法

- 麻酔をかけた成魚を吸収紙の束の上に置くことから手順を開始します。次に、滅菌カミソリの刃を使用して尾びれを切断し、魚を真水の入ったタンクにすばやく移して回復します。テールクリップを溶解バッファーを含むきれいなチューブに移します。溶解バッファーには、細胞の原形質膜と核膜を可溶化する非イオン性界面活性剤が含まれています。このバッファーには、タンパク質を分解してDNAをライセートに放出するプロテイナーゼKと呼ばれる酵素も含まれています。また、ヌクレアーゼを分解し、DNAをヌクレアーゼ消化から保護します。

次に、テールクリップ付きのチューブをインキュベーターに一晩置いて、連続回転で摂氏55度で組織を完全に分解します。次に、チューブを摂氏95度で15分間加熱してプロテイナーゼKを不活性化し、チューブを遠心分離して未消化物質をペレット化し、DNAを含む上清を別のチューブに移します。アルコールを加えてDNAを沈殿させ、再度遠心分離してDNAをペレットに集めます。次のプロトコルでは、成体のゼブラフィッシュのテールクリップと全胚からDNAを単離します。

- DNA調製の日に、新鮮なプロテイナーゼKを1ミリグラム/ミリリットルの濃度で溶解緩衝液に加える。組織は、フィンクリップを使用して成魚から、または胚魚から採取できます。

まず、トリカイン溶液で魚を麻酔します。鰓の動きが遅くなるまで待ちます。次に、魚をティッシュの山に置き、滅菌のかみそりの刃で、長さ約2〜3ミリメートルの尾びれの小片を切り取ります。回収のために、魚を真水を入れたラベル付きのタンクにすばやく置きました。

滅菌ピペットチップ付きのフィンクリップを手に取り、100マイクロリットルのDNA溶解バッファーで満たされたチューブに移します。動物のタンクとチューブの両方にラベルを貼ってください。採取したすべての組織を少なくとも4時間、摂氏55度で一晩までインキュベートします。

インキュベーション後、チューブを摂氏95度で15分間加熱することにより、プロテイナーゼKを不活性化します。これらのサンプルは、すぐにPCRに使用する必要がありますが、マイナス20°Cで最大3ヶ月間保存することもできます。