層状寒天マウント:倒立顕微鏡による長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚の調製

- E3培地に胚が入ったシャーレから始めます。トリカインを添加して胚を麻酔し、フェニルチオリア、PTU溶液を添加して色素形成を抑制します。解剖顕微鏡の助けを借りて、胚を脱角化します。

ガラスピペットを使用して、脱葉胚の1つを中央に浅いガラス底の小さなシャーレに移し、余分な培地を取り除きます。次に、胚の歪みと運動性を最小限に抑えるために最適な濃度のアガロース溶液をマイクロフュージチューブに入れ、加熱します。熱による胚の損傷を避けるために、温度を摂氏30度に下げます。

アガロースの最初の層を胚の上に注ぎ、浅い井戸を完全に満たします。ウェルの上に別のカバーグラスを置き、その上に1%のアガロースを加えます。2番目の層はカバーガラスを所定の位置に保持します。

アガロースが固まったら、トリカインを含むE3培地をシャーレに入れます。これは3番目の層で、アガロースと胚を水分補給します。以下のプロトコールでは、ゼブラフィッシュ胚の層状寒天マウントを行い、長時間のラプスイメージングを行います。

- マウントする直前に、アガロース溶液を65°Cに加熱した後、胚が熱で傷つかないように約30°Cまで冷まし、アガロース溶液にトリカインを加えます。底が35mmのガラス皿を使用し、底がゼロのガラスで覆われています。ガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、デホリオン化胚の側面の1つを皿の底に向けて静かに置きます。次に、残っているE3をマイクロピペットで慎重に取り出します。

胚を覆うために皿の底に取り付けられたカバーガラスによって作成された小さなウェルに最初のアガロース溶液を追加し、アガロースが小さなウェルを覆うが、それがオーバーフローしないようにします。小さなウェルをカバーガラスで覆い、2つのカバーガラスの間に胚がある狭いアガロースで満たされた空間を作ります。カバーガラスの上部に1%アガロース溶液の層を皿の底全体に置き、カバーガラスが固まるときに所定の位置に保たれます。次に、皿の残りの部分に0.02%のトリカインを含むE3を入れて、システムの水分を保ちます。レイヤー1に最適なアガロース濃度を特定するには、アガロースの濃度を上げる中で胚をマウントし、タイムラプスイメージングを実施して胚の歪みと運動性を最小限に抑える濃度を特定し、その結果に基づいてより細かい範囲の濃度をテストします。

- このプロトコルの最も重要なステップは、レイヤー1に最適なアガロースの濃度を特定することです。0.030%、0.032%などのさまざまなナノ濃度のアガロースをテストして、最適な濃度を見つけます。