2光子レーザー軸索切開術:ゼブラフィッシュ胚の軸索を損傷し、軸索の回復を観察する方法

- 受精後24時間で始まる色素形成を阻害するために、目的の胚をフェニルチオ尿素、PTU、リンゲル溶液に入れます。これにより、この手順に必要な発達中の解剖学的構造がより見えるようになります。トリカイン麻酔した胚をイメージングチャンバーに移します。スライドガラスを上に置き、顕微鏡で観察します。損傷する軸索に焦点を当てますが、これはGFPを遺伝子導入的に発現するため、488ナノメートルのレーザーで見ることができます。

サイトの変更前画像を撮影します。次に、910ナノメートルのレーザーで軸索を観察し、GFPが赤色に蛍光を発します。このレーザーの強度を上げて、周囲の組織に影響を与えずにターゲット領域を傷つけます。このプロセスは軸切開術と呼ばれます。最初のレーザーで新しい画像を撮影して、散乱した破片として現れる軸索切開を確認します。次のプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚の末梢感覚軸索の軸索切開術を 2光子レーザーを使用して行います。

- カスタムメイドの2光子スコープが研究室にない場合は、Zeiss 510共焦点2光子顕微鏡を使用して軸索を切断することもできます。まず、マウントされた胚をステージに置き、25倍の水対物レンズを使用して焦点を合わせます。次に、2つの光子レーザーとアルゴンレーザーをマルチトラック設定でオンにして、一方から他方に切り替えることができるようにします。

GFPの検出には両方のレーザーが使用されますが、2つの光子の発光は赤で、アルゴンレーザーの発光は緑で視覚化され、2つを区別します。アルゴンレーザーを使用して、損傷する軸索を特定します。Z設定で、最初と最後の光学セクションをマークし、共焦点画像を撮影して、Zスタックの最大投影を作成します。

アルゴンレーザーをオフにし、2光子レーザーをオンにします。約9%の透過率の強度でスキャンして、軸索にまだ焦点が合っていることを確認します。[停止]ボタンをクリックして、切り抜きツールが使用可能になります。[切り抜き] を使用して、対象領域を拡大します。通常、約70倍にズームします。損傷する軸索の領域を選択し、この領域に焦点を合わせます。ズームは[モード]タブで確認できます。

次に、[チャネル]タブで、2つの光子の強度を約9%の透過率から15%から30%の透過率に変更します。新しい設定を有効にするには、Fast XYボタンをクリックし、その後すぐにStopをクリックして、過剰な損傷を防ぎます。手順が機能した場合、軸索は散在する破片と見なす必要があります。最後に、軸索が実際に損傷したことを確認するには、488ナノメートルのアルゴンレーザーに戻します。別の共焦点画像を撮影し、Zスタックの最大投影を作成します。