JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 3:58 分 • April 30th, 2023
- 注射の1日前の夜、2匹の雌と2匹の雄の魚を分割された繁殖水槽に入れます。翌朝、仕切りを取り外し、水槽の底に卵が観察されるまで魚を繁殖させます。卵を集めて、殺菌剤であるメチレンブルーを含むE3培地で洗います。卵子を顕微鏡で観察し、未受精卵を取り出します。未受精卵は透明な卵黄膜を持っていますが、受精卵は暗い卵黄膜を持っています。
10個の胚を別のペトリ皿に未注入のコントロールとして保管します。トランスファーピペットを使用して、室温で胚をマイクロインジェクションプレートのトラフに位置合わせし、顕微鏡下に置きます。マイクロインジェクション針を絨毛膜を通して卵黄にそっと押し込み、フェノールレッドなどのマーカーを含む目的の化合物をゆっくりと注入します。細胞質の流れにより、化合物は胚細胞に拡散します。
注入後、E3培地で胚をメチレンブルーで摂氏28度に成長させます。胚の健康状態を常にチェックしてください。死んだ胚や異常に発生している胚をすべて取り除き、培地を毎日交換します。次のプロトコルでは、マイクロインジェクションを使用して、リボ核タンパク質、またはRNP複合体をゼブラフィッシュの胚に導入します。
- まず、テキストプロトコルに記載されているように、注射を行う前夜にゼブラフィッシュの被験者を繁殖のために準備します。次に、Cas9タンパク質とsgRNAを2対1の比率で組み合わせます。溶液を室温で5分間インキュベートし、Cas9とsgRNAがリボ核タンパク質複合体を形成します。次に、十分なRNaseフリー水に0.5マイクロリットルの2.5%フェノールレッド溶液を加えて、最終容量を5マイクロリットルにします。
注射針を準備するには、マイクロピペットプーラーを使用して1ミリメートルのガラスキャピラリーを引っ張ります。次に、得られたガラス針の先端をかみそりの刃で切断して、角度のついた開口部を取得します。マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置きます。光学顕微鏡を使用して、針がペトリ皿に1ナノリットルの溶液を一貫して注入するまで、注入圧力を調整します。
- 胚マイクロインジェクションを行う前に、色素のみの溶液を使用して針を準備し、コントロール胚を注入する練習をし、発生の24時間後の生存を記録します。注射されていないコントロールと比較して、90%を超える生存率を得ることができるはずです。
- 次に、コントロール集団として10〜15個の胚を選択し、それらを別のラベル付きペトリ皿に入れます。トランスファーピペットを使用して、残りの胚を室温の注入プレートに慎重に並べます。解剖顕微鏡下で、各胚の卵黄嚢に1ナノリットルの溶液を注入します。次に、注入した胚を標識されたペトリ皿に戻し、メチレンブルーの1X E3培地で覆います。注入した胚を摂氏28度のインキュベーターに24時間置きます。次に、注入された胚を検査して、死亡した個体または異常に発達している個体を切除します。