免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

この手順の全体的な目的は、免疫電子顕微鏡観察に向けてマウス脳組織を調製することです。まず、動物への灌流によって脳を固定します。次に、脳を切断し、切片を免疫組織化学的に処理します。

手順の3番目のステップは、切片の固定、脱水、および包埋です。手順の最終ステップは、超薄切片を作成することです。最終的に、中枢神経系の異なる領域および細胞型における、さまざまなタンパク質の分布を高空間分解能で示す結果を得ることができます。

こんにちは。ロチェスター大学神経生物学・解剖学部、Esca研究室のMaria Trombleyです。本日は、免疫電子顕微鏡観察用のマウス脳組織の調製手順について解説します。当研究室では、発達期、経験依存的な可塑性、および老化におけるミクログリアとシナプスの相互作用を研究するために、この手順を用いています。

それでは始めましょう。心臓内灌流によりマウス脳を固定した後、4°Cの約10 mLのホルムアルデヒドで2時間後固定します。4°Cの1X PBSで、振動装置を用いて10分間ずつ3回洗浄し、氷冷した1X PBSで洗浄します。その後、直ちに脳を50 µmの厚さで横断的に切片化します。

細筆を使用して、選択した切片を4°Cの1 XPBSを満たしたガラスバイアルに転送します。残りの切片は、変質させることなく最大数年間保存するため、-20°Cの凍結保存液（Cryoprotectant）で保存してください。各ガラスバイアルでの染色は、最大10枚の遊離切片までとしてください。

転写ピペットを使用して、1X PBSを新鮮な0.1%水素化ホウ素ナトリウム含有PBSに置換します。切片が乾燥するのを防ぐため、溶液の交換は迅速に行ってください。30分間インキュベートし、1X PBSで10分間ずつ3回切片を洗浄します。気泡がすべて除去されていることを確認し、使用する二次抗体に適した0.5%ゼラチンおよび5%正常血清を含む1X PBSでブロッキングを行います。

2時間インキュベートします。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加えます。48時間インキュベートします。

1X PBSで10分間、3回洗浄します。ブロッキング溶液で希釈したビオチン標識二次抗体とともに、2時間インキュベートします。前述と同様に、1X PBSで10分間、3回洗浄します。

ブロッキング溶液で希釈したストレプトアビジン horseradish peroxidase を用いて1時間インキュベートします。切片を 1 XPBS で1回、次いで 1 XTBS で2回、それぞれ10分間ずつ洗浄します。標識を可視化するため、1 XTBS 中に 0.05%dab と 0.01%hydrogen peroxide を含む調製直後の溶液を用いて切片をインキュベートします。

染色はっきりと濃褐色になったか、または反応開始から5分が経過した時点で、XTBSで切片をすすぎ、反応を停止させます。次に、XTBSで1回、1 x PBで2回（各10分間）すすぎます。ドラフトチャンバー内で、細筆を用いて切片を1 XPBを満たしたマルチウェル培養プレートに移します。

細筆を用いて1ウェルからPBを除去し、直ちに切片を平らに広げます。次のウェルに移る前に、1%四酸化オスミウムを含む1x PB溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。OSM処理した切片をガラスバイアルに移します。

10分間のXPBによる洗浄を3回行います。エタノールの濃度を段階的に上げて切片を脱水します。その後、本プロトコルの本文に記載されている通り、プロピレンオキシド処理を行います。

プロピレンオキシドで洗浄した細筆を用い、切片を新しく調製したデュパント樹脂（dupant resin）へ移します。一晩浸透させるため、切片を入れたディッシュを55 °Cのオーブンに10分間入れます。樹脂を柔らかくするため、プロピレンオキシドで洗浄した筆を用いて、クロル埋包フィルム（chlor embedding film）に樹脂の薄い層を塗布します。

切片をフィルム上に転写し、別の封入フィルムで覆います。樹脂を広げるため、上から約2 gの軽荷重を均等に配置します。インキュベーター内で55 °Cで48〜72時間保持し、樹脂を重合させます。重合後、実体顕微鏡下で上層の封入フィルムにある荷重を取り除きます。

2 mm × 2 mmの関心領域を選択し、カミソリの刃を用いてフィルムから切り出します。これらの関心領域を樹脂ブロックの先端に瞬間接着剤で固定します。55 °Cのインキュベーターで1時間キュアリング（硬化）させます。

カミソリを用いて、極薄切片の吸引に最適な形状である等脚台形の形に樹脂ブロックを切り揃えます。ミクロトームとガラスナイフを使用し、組織表面の接着剤を除去して平坦な面にします。これは吸引のためです。

ガラスナイフのボートに二回蒸留水を満たし、0.5から1 µmの厚さで数切片を作製します。Perfect loopを用いて、切片をSuperFrostスライドガラス上に転写します。80 °Cの加熱プレートで1分間乾燥させた後、0.1% トルイジンブルーで1分間染色します。

二回蒸留水を入れた洗浄ボトルを使用して、過剰な染料を洗い流します。光学顕微鏡下で切片を観察し、染色された組織と樹脂を区別します。組織と樹脂の境界が切片の中央付近に達するまで、セミシンセクションを切出します。ガラスナイフをダイヤモンドナイフに交換し、ボートに二回蒸留水を満たします。

銀を銀金超薄切片にカットします。厚さ60〜80 nanometersのセクションを作成してください。微細な反転ピンセットを使用して、セクションを銅メッシュグリッド上に慎重に回収します。

コントラストを高めるため、フィルターペーパー上でグリッドを乾燥させます。細い反転ピンセットを使用して、グリッドをクエン酸鉛溶液の一滴に2分間浸します。その後、二回蒸留水のバスに3回連続で浸し、グリッドを丁寧に洗浄します。

フィルターペーパー上でグリッドを乾燥させ、後で電子顕微鏡で観察するためにグリッドボックスに保存します。電子顕微鏡でグリッドを観察し、免疫染色の結果だけでなく、細胞成分の形態、すなわち細胞内小器官およびそれらの相互関係を視覚化します。

ここでは、IBA1の代表的な免疫染色の結果を光学顕微鏡レベルで示しています。IBA1の細胞分布はミクログリアに限定されており、これにより電子顕微鏡レベルでの特異性が確認されます。IBA1で免疫染色されたミクログリアの細胞体および突起が確認できます。

免疫ペルオキシダーゼDAB染色は、電子密度の高い沈殿物として現れます。Iba1免疫染色の他の例では、ミクログリア突起がさまざまなサイズと形状を示しています。高倍率では、あるミクログリア突起内部にさまざまな細胞内小器官が認められ、また、別のミクログリア突起と、シナプスを含む近接するニューロピル要素との超微形態学的関係が明らかになります。

マウス脳組織を免疫電子顕微鏡観察用に準備する方法について説明しました。この手順を行う際は、すべてのステップを厳格に遵守し、脳組織を慎重に扱うことが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。