JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:19 分 • April 30th, 2023
レンチウイルスは、RNA遺伝物質を含むレトロウイルスです。このウイルスは、がん細胞株に導入遺伝子を効率的かつ安定的に導入する方法を提供します。まず、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレンチウイルスを含むチューブにノイラミニダーゼを添加します。チューブを摂氏37度に1時間置くと、ウイルスの結合効率が向上します。
次に、腫瘍細胞懸濁液を含むチューブを遠心分離してペレットを形成します。ポリブレンを含むマンモスフィア培地を添加して、細胞を再懸濁します。ポリブレンは、レンチウイルスの感染効率を高めるカチオン性ポリマーです。次に、ウェルあたりの腫瘍細胞の最適な数を6ウェルの組織培養プレートにプレートします。必要な量のレンチウイルスを培養プレートの各ウェルに加えます。
プレートを回転させて内容物を混合し、二酸化炭素を連続的に供給しながら摂氏37度に96時間保ちます。レンチウイルスは細胞内に侵入し、RNAを放出します。ウイルス逆転写酵素は、RNAを二本鎖DNAに変換し、宿主ゲノムに組み込みます。プレートを蛍光顕微鏡下に置き、形質導入が成功するか細胞をモニターします。形質導入された細胞は、GFP発現により蛍光を発します。
プロトコル例では、PDX解離腫瘍細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入を行います。
腫瘍細胞を形質導入するには、単離された細胞を遠心分離して、2ミリリットルのマンモスフィア培地に再懸濁します。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを2ミリリットルのマンモスフィア培地に再懸濁し、20マイクロリットルのポリブレンを補充します。次に、ウェル当たり5番目の生存腫瘍細胞を1ウェル当たりの2回10回プレートにし、超低接着性の6ウェル組織培養プレートとレンチウイルス粒子を10の多重感染で細胞に
添加する。プレートを渦巻かせてウイルスを細胞と混合し、摂氏37度と二酸化炭素5%で共培養物を最大96時間インキュベートし、最初の24時間後に500マイクロリットルの新鮮なマンモスフィア培地を追加します。細胞の少なくとも10%がGFP陽性である場合、形質導入した細胞を少なくとも1つのウェルから氷上の15ミリリットルの円錐管に移し、ウェルを1ミリリットルのマンモスフィア培地で洗浄します。
洗浄液を細胞とプールし、腫瘍細胞を10ミリリットルのHBSSとHEPESで遠心分離します。最後に、50マイクロリットルの地下マトリックス抽出物に細胞を氷上に再懸濁し、埋め込まれた細胞を0.5ミリリットルのインスリン注射器にロードして再移植します。