直接相互作用による3D共培養:がん細胞と単球の共培養による相互作用の研究

まず、蛍光色素で急冷したタンパク質基質であるDQコラーゲンIVを細胞外マトリックス抽出物またはECMEに加えます。この抽出物を2ウェルスライドの各ウェルに注ぎます。最初の井戸を共培養とラベル付けし、2番目の井戸をコントロールとラベル付けします。蛍光標識したがん細胞懸濁液を適量ウェルに加え、スライドを摂氏37度で所望の時間インキュベートして細胞接着を促進します。

必要量の単球細胞懸濁液を最初のウェルに加えます。ECMEを摂氏37度で固めます。がん細胞と単球の培養培地を等比で各ウェルに注ぎ、二酸化炭素環境でスライドを摂氏37度で所望の期間インキュベートします。共培養ウェルでは、がん細胞は単球の走化性タンパク質などのタンパク質を分泌して単球を引き付けます。

対照的に、単球はマトリックスメタロプロテイナーゼまたはMMPを産生してコラーゲンを分解し、がん細胞の浸潤を促進します。共焦点顕微鏡でスライドを観察します。DQコラーゲンの分解は蛍光を発し、これは共培養細胞でより多く見られ、細胞の相互作用を示しますが、制御細胞ではあまり見られません。次のプロトコルでは、乳がん細胞を単球と共培養して、それらの相互作用を研究します。

細胞培養前にBRC細胞および単球を市販のクマリンおよびローダミンで標識するには、目的の6つのBRC細胞の10倍×2倍の単層を調製し、標準培地を蛍光色素の十分な予温された作業溶液に置き換えてください。細胞を摂氏37度で、加湿した5%二酸化炭素環境で30分間インキュベートします。次に、色素溶液を吸引し、十分な1x PBSを使用して細胞を穏やかにすすぎます。

PBSを吸引し、標準培地を追加します。細胞をトリプシン化するには、フラスコに0.05%トリプシンと0.48ミリモルEDTAの2ミリリットルを加え、細胞を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。トリプシン化を止めるために200マイクロリットルのFBSを追加し、サプリメントなしで対応する培地を7ミリリットル追加します。

ピペッティングで細胞を再懸濁し、細胞の10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移してカウントします。次に、細胞を室温で430 x gで5分間ペレット化し、上清を廃棄し、予熱した蛍光色素ワーキング溶液をミリリットル使用して細胞を懸濁します。

細胞懸濁液を摂氏37度で加湿した5%二酸化炭素環境で30分間インキュベートします。細胞を再度ペレット化した後、色素ワーキング溶液を廃棄し、5〜7ミリリットルの1x PBSを使用して細胞を穏やかに再懸濁します。次に、細胞をもう一度ペレット化し、PBSを廃棄した後、細胞を5〜7ミリリットルの標準培地に再懸濁しました。

細胞懸濁液を10マイクロリットル数えます。ウェルの底に十分なECMEを広げて、4ウェルチャンバースライドシステムの各ウェルに均一な層を