機械的解離:組織から生細胞を得る方法

まず、組織片の重量を量り、その長さ、幅、高さを測定します。培地を入れた培養皿にティッシュを置き、メスで細かく刻みます。パスツールピペットを使用してすべてをCチューブに移し、均質化します。

チューブを機械式解離器に置き、必要に応じてサイクルを実行します。この装置は、機械的な力を使用して、表面タンパク質を含む細胞の完全性を維持しながら、組織サンプルから生存可能な単一細胞を抽出します。ホモジネートを遠心分離チューブに固定したセルストレーナーでデカントします。

残りの組織を再ホモジネートし、セルストレーナーを介してホモジネートをチューブに濾します。ホモジネートを遠心分離し、上清を取り除きます。次に、細胞ペレットを培地に再懸濁し、少量の細胞懸濁液をトリパンブルー染色剤の入ったチューブに移します。

染色後、細胞を血球計算盤スライドに移します。透明な生存細胞を数えます。死んだ細胞は、細胞膜が無傷ではないため、染色を吸収します。次のプロトコルでは、CD45+細胞の定量的および定性的な分析のために、新鮮なヒト組織の非酵素的解離を行います。

- まず、組織サンプルの重量を量り、次に組織の長さ、幅、高さを測定します。次に、組織断片を、1ミリリットルの適切な化学的に定義された無血清の造血細胞培地を含む小さなペトリ皿に移し、滅菌メスを使用してサンプルを1〜2平方ミリメートルの小さな断片にさいの目に切ります。次に、ディッシュの内容物を機械式解離器Cチューブに移し、ディッシュとメスを2ミリリットルの培地ですすいでください。

洗浄液をCチューブに加え、8.01機械的解離プログラムを2回連続して実行して、組織断片を1つの細胞懸濁液に穏やかに均質化します。2回目のサイクルの後、ホモジネートを40マイクロメートルのセルストレーナーを介して50ミリリットルの円錐管にデカントします。次に、ペトリ皿を洗浄したのと同じパスツールピペットを使用して、Cチューブに残っている液体をセルストレーナーに移します。

次に、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、ろ過した液体を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、さらに3ミリリットルの培地でCチューブをすすぎます。この洗浄液をセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移します。次に、均質化されていない組織をきれいな1ミリリットルの先端でストレーナーの周りをゆっくりと動かし、組織に閉じ込められた残留液体を最大量50ミリリットルのチューブに絞ります。次に、セルストレーナーを元のCチューブの上に逆さまに置き、さらに3ミリリットルの培地でストレーナーをすすぎます。これにより、均質化されていない組織がCチューブに戻ります。

先ほど示したように、さらに2サイクルにわたって組織を再ホモジネートし、次に2番目のホモジネートを再びセルストレーナーに注ぎます。Cチューブをさらに3ミリリットルのメディウムですすいでください。次に、上清をストレーナーでろ過し、示したように、組織から残留液体を絞り出します。この時点で、15ミリリットルのチューブには約2.5ミリリットルの単一細胞懸濁液が存在し、50ミリリットルのチューブには約9ミリリットルが観察されます。

組織上清を細胞から分離するには、まずホモジネートの両方のチューブを室温で600Gで15分間遠心分離します。15ミリリットルのチューブから上清を1.5ミリリットルのチューブにデカントし、摂氏4度に置き、50ミリリットルのチューブから上清を捨てます。.次に、各チューブを硬い表面にそっとたたいて、各細胞ペレットを分解します。

500ミリリットルのチューブにルーズセルペレットを500マイクロリットルの培地で再懸濁し、細胞を15ミリリットルのチューブに移して第2のペレットを再懸濁します。次に、50ミリリットルのチューブを別の500マイクロリットルの培地ですすぎ、洗浄液を15ミリリットルのチューブに移して、細胞の回復を最大化します。トリパンブルー排除により生細胞数をカウントした後、細胞懸濁液をペレット化します。

最後に、予約した組織の上清をスピンダウンします。次に、ペレットに触れたり邪魔したりすることなく、上清を少なくとも1つのきれいなチューブに慎重に移し、将来の下流分析のために摂氏マイナス80度で保存します。