軟寒天コロニー形成アッセイ:癌細胞増殖に対する新規化合物の影響をテストする方法

まず、円錐形のチューブに適切な濃度の溶融アガロースを取り、それに必要な量の温かい培地を加えます。ゆっくりと反転させて内容物を混ぜます。この混合物を6ウェルプレートの各ウェルに加え、固化させます。これが最下層です。次に、がん細胞を目的の化合物で処理し、必要な濃度のアガロースを添加します。

次に、ミリリットルあたり必要な数の細胞を含むこの混合物を各ウェルに注ぎます。これはセルを含むレイヤーです。培地が固まったら、プレートを摂氏37度で1週間インキュベートします。アガロースを培地に混合してフィーダー層を調製し、この混合物に目的の化合物を補充します。このフィーダー層を各ウェルに静かに加え、固化させて、プレートを摂氏37度でインキュベートします。

この給餌手順を毎週繰り返して、コロニーが形成されるまで細胞に培地を補充します。目的の化合物が腫瘍原性の阻害剤である場合、細胞増殖を抑制し、ウェル内のコロニーをほとんど生成しません。次のプロトコルでは、軟寒天コロニー形成アッセイを実施して、乳がん細胞の腫瘍形成性に対するPADI阻害剤の影響を研究します。

この手順は、3%2-ヒドロキシエチルアガロースを準備することから始めます。清潔で乾燥した100ミリリットルのガラス瓶に、0.9グラムの2-ヒドロキシエチルアガロースを加え、続いて30ミリリットルの蒸留水を加えます。混合物を15秒間電子レンジで加熱し、静かに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を繰り返します。次に、ボトルを含む溶液を15分間オートクレーブします。

アガロース溶液を室温まで冷ましてから、さらに使用してください。5ミリリットルと10ミリリットルのピペットを37°Cのインキュベーターで予備温し、取り扱い時にアガロースがピペット内で固まらないようにします。ボトルの蓋を部分的に緩め、既製の3%2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を15秒間電子レンジで加熱します。次に、溶液を静かに渦巻き、さらに15秒間電子レンジで加熱します。

アガロース溶液を渦巻くときは、空気にさらされると溶液が浮き上がり、こぼれる可能性があるため、注意してください。ボトル内に固体ゲルが残っている場合は、さらに数秒間電子レンジで加熱します。アガロース溶液が入ったボトルは、次のステップで摂氏45度の水浴に保管して、アガロース溶液が早期に固まるのを防ぎます。

次に、予め温めたピペットを使用して、温めた12ミリリットルの培地を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。すぐに3ミリリットルの3%アガロース溶液を加え、円錐形のチューブを静かに反転させてアガロースを培地と混合します。次に、この混合物の2ミリリットルを、気泡を形成せずに6ウェル培養プレートの各ウェルに静かに加えます。6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に1時間インキュベートし、混合物を固化させます。

混合物が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間入れます。これで、最下層を使用する準備が整いました。

この手順の難しい側面は、すべての細胞が均等に分布し、溶融したアガロースゲルが各ウェルに添加する前に固まらないようにし、液体アガロースゲルを添加する前に細胞が培地で混合されていることを確認することです。さらに、ピペットは、取り扱い中に溶液が固まらないように、事前に温めておきます。

細胞含有層を調製するには、まずMCF10DCIS細胞をトリプシン化し、それらを1ミリリットルあたり40,000細胞の細胞濃度に希釈します。次に、予め温めたピペットを使用して8ミリリットルの培地を取り、滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。すぐに2ミリリットルの3%アガロースをコニカルチューブに加え、穏やかに反転させてアガロースを培地と混合します。気泡の形成は避けてください。

次に、細胞の2ミリリットルを採取し、DMSO中の2マイクロモルBB-クロルアミジンで処理するか、またはコントロールとしてDMSOのみで処理します。処理後、細胞を0.6%アガロースと1対1の希釈液で混合し、最終濃度のBB-クロル-アミジンを1マイクロモルにします。次に、細胞-アガロース混合物を1ミリリットル取り、6ウェル培養プレートの最下層に静かに加えます。

6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に少なくとも15分間置き、最上層が固化するまで待ちます。混合物が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに1週間入れてから、供給層を追加します。既製の3%2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を以前と同様に電子レンジで加熱し、アガロース溶液ボトルを摂氏45度の水浴で平衡化することにより、供給層の準備を開始します。

1ミリリットルの3%アガロース溶液と9ミリリットルの温かい媒体を50ミリリットルの円錐管に混合し、アガロースを媒体と混合するために穏やかに反転させます。気泡の形成を避けてください。混合物をBB-クロル-アミジンで処理した後、底層と軟層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルの混合物を静かに加えます。次に、6ウェル培養プレートを摂氏4度の平らな面に水平に少なくとも15分間置き、混合物を固化させます。

フィーダー層が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。この給餌手順を毎週繰り返し、1ミリリットルの0.3%アガロース培地処理溶液を既存のフィーダー層に重ねて、コロニー形成が観察されるまで細胞に新しい培地を補充します。