乳腺脂肪パッドの脱細胞化:乳腺脂肪パッドからの細胞外マトリックスハイドロゲルの誘導

まず、トリプシン-EDTA溶液を入れた皿に乳腺脂肪パッドまたはMFPを置き、細胞マトリックスの接着を切断するために所望の期間インキュベートします。MFPを脱イオン水で洗い、ストレーナーで濾します。攪拌棒付きのビーカーにティッシュを入れ、Triton X-100を加えます。組織の細胞外マトリックスの成長因子に影響を与えずに細胞を攪拌して溶解します。

MFPを濾し、脱イオン水ですすいでください。組織をビーカーに戻し、デオキシコール酸を加えて残りの細胞を溶解します。次に、MFPを濾し、汚染を防ぐためにペニシリン-ストレプトマイシンを含む脱イオン水を入れたビーカーに入れます。ビーカーを摂氏4度で一晩インキュベートします。

MFPを濾し、エタノールと過酢酸を含むビーカーに入れます。過酢酸は、組織の細胞外マトリックスの剛性を高めます。しばらく攪拌し、濾しのステップを繰り返します。MFPをPBSで洗浄し、次に脱イオン水で洗浄します。濾した複合機をプロパン-1-オールを含むビーカーに移します。

しばらく攪拌し、内容物を濾し、MFPを脱イオン水で洗います。MFPを乾燥させ、マイナス80°Cで保管します。次のプロトコルでは、マウスの乳腺脂肪パッドの脱細胞化を行います。

まず、MFPを5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を含む6センチメートルの皿に入れます。70%エタノールを皿にスプレーして拭き取り、摂氏37度で1時間インキュベートします。0.7mmのストレーナを使用して、ティッシュに水を3回注ぎ、MFPを脱イオン水で洗います。鉗子を使用して、洗浄の合間に組織を手動でマッサージします。

次に、デリケートなタスクワイプでティッシュを短時間乾燥させ、重量を量ります。乾燥した組織を、適切なサイズの攪拌子が入ったオートクレーブ済みのビーカーに入れ、組織1グラムあたり60ミリリットルの3%t-オクチルフェノキシポリエチレンエタノールで組織を覆います。室温で1時間撹拌します。次に、ビーカーの中身をストレーナーに捨てます。

ビーカーを脱イオン水ですすぎ、これをティッシュに注ぎます。このすすぎプロセスをさらに2回繰り返し、すすぎの合間に鉗子を使用して組織を手動でマッサージするようにしてください。この後、デリケートなタスクワイプでティッシュを短時間乾かし、重量を量ります。ティッシュとスターバーを同じビーカーに戻し、ティッシュ1グラムあたり60ミリリットルの4%デオキシコール酸で覆います。室温で1時間撹拌します。

次に、ビーカーの中身をメッシュストレーナーに捨てます。ビーカーを脱イオン水ですすぎ、これをティッシュに注ぎます。このすすぎプロセスをさらに2回繰り返し、すすぎの合間に鉗子を使用して組織を手動でマッサージするようにしてください。すすいだティッシュを繊細な作業で短時間乾かし、拭き取り、重さを量ります。

乾燥したティッシュを、1%ペニシリンストレプトマイシンを補給した新鮮な脱イオン水と一緒に同じビーカーに入れます。.ビーカーをパラフィンフィルムでしっかりと覆い、摂氏4度で一晩放置します。翌日、ビーカーの中身をストレーナーに排出します。デリケートな作業でティッシュを短時間乾かし、拭いて重さを量ります。次に、MFPを適切なサイズの攪拌棒と同じビーカーに入れます。

組織1グラムあたり4%エタノールと0.1%過酢酸を含む60ミリリットルの溶液で組織を覆います。室温で2時間攪拌します。ビーカーの中身を0.7ミリメートルのストレーナーに捨てます。鉗子を使用して組織を手動でマッサージし、内容物をビーカーに戻します。ティッシュ1グラムあたり60ミリリットルの1X PBSで覆ってティッシュを洗います。

室温で15分間撹拌します。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。次に、ビーカーの中身を0.7ミリメートルのストレーナーに捨てます。鉗子を使用して、手動でティッシュをマッサージし、内容物をビーカーに戻します。ティッシュ1グラムあたり60ミリリットルの脱イオン水で覆って組織を洗います。

室温で15分間撹拌します。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。洗ったティッシュをデリケートな作業で短時間乾かし、拭いて重さを量ります。ティッシュと内容物をストレーナーに捨て、鉗子を使用して手動でティッシュをマッサージします。内容物をビーカーに戻し、組織1グラムあたり60ミリリットルの100%n-プロパノールで組織を覆います。

室温で1時間撹拌します。次に、デリケートなタスクワイプでティッシュを短時間乾かし、体重を量ります。ティッシュと内容物を0.7ミリメートルのストレーナーに捨て、鉗子を使用して手動でティッシュをマッサージします。内容物をビーカーに戻し、ティッシュ1グラムあたり60ミリリットルの脱イオン水で覆ってティッシュを洗います。

室温で15分間撹拌します。この洗浄プロセスを3回繰り返します。この後、デリケートなタスクワイプでティッシュを短時間乾かし、重さを量ります。組織をラベル付きの15ミリリットルチューブに移し、摂氏マイナス80度で一晩凍結します。