CTC免疫蛍光アッセイ:循環腫瘍細胞の特性評価技術

- まず、分離された循環腫瘍細胞またはCTCを、細胞を流体のせん断および圧力損傷から保護する抗結合溶液を使用して必要な濃度に希釈します。次に、ポリリジンコーティングされた顕微鏡スライドと細胞遠心フィルターカードを細胞遠心ファンネルアセンブリに組み立てます。細胞懸濁液をアセンブリの漏斗ポートに移し、続いて細胞遠心分離を行います。

遠心力は、スライド上の円形領域に細胞の単層を集中させ、堆積させます。シリコンアイソレーターを使用して、細胞が堆積した領域を分離します。乾燥したら、パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定します。次に、細胞表面上の任意の非特異的結合部位に容易に結合するタンパク質を含む適切なブロッキング溶液で細胞をインキュベートします。

次に、目的の蛍光標識抗体溶液で細胞を標識します。蛍光色素でタグ付けされた抗体は、細胞表面上の特定の標的分子を認識して結合します。サンプルを洗浄して、結合していない抗体をすべて取り除きます。イメージング用のサンプルを準備するためのマウント溶液を追加します。

蛍光顕微鏡を使用して、CTC上の標的抗原に結合した抗体-蛍光色素複合体から放出される光を検出します。このプロトコルでは、非小細胞肺がん患者サンプルで CTC の免疫蛍光アッセイを行います。

- 免疫蛍光染色のために、血球計算盤で細胞を数え、濃縮されたサンプルを0.2%抗結合溶液濃度の100マイクロリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍に希釈します。次に、50マイクロリットルの結合防止溶液を浸した綿棒を使用して、サンプルチャンバーの輪郭を湿らせ、ポリリジンガラススライドをサンプルチャンバーに配置します。

チャンバーを閉じ、ピペットを3回上下させてマイクロピペットの先端を結合溶液でコーティングしてから、サンプルを上清の最後の100マイクロリットルに再懸濁します。細胞溶液をサンプルチャンバーに移し、専用の遠心分離機でサンプルを毎分400回転、低加速で4分間サイトスピンします。

遠心分離の最後に、堆積領域の周囲にシリコンアイソレータを置き、スライドを微生物学的安全キャビネットの下で2分間乾燥させます。次に、サイトスピンしたサンプルを100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、続いて室温で1回の洗浄ごとに200マイクロリットルのPBSで2分間の洗浄を3回行います。

最後の洗浄後、室温でブロッキング試薬に30分間インキュベーションして非特異的結合をブロックし、その後、目的の抗体溶液100マイクロリットルで標識します。ラベル付きのスライドを100 x 15ミリリットルのペトリ皿に置き、2ミリリットルの滅菌水で湿らせた吸収紙の上に置き、皿を摂氏4度で閉じて一晩置き、光から保護します。

翌朝、デモンストレーションに従ってサンプルをPBSで3回洗浄し、10マイクロリットルの適切なマウント溶液とガラスカバースリップでサンプルをマウントします。次に、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。