0 閲覧数 • 5:55 分 • April 30th, 2023
- まず、安楽死させたマウスを解剖ボードに置きます。腹部のすぐ上で、皮膚と腹膜を切り取ります。横隔膜に穴を開け、肋骨と胸郭に沿って気管まで切り込みます。気管に小さな切開を作成します。カリーナを傷つけずに気管の内側に針をそっと挿入し、鉗子で固定します。肺の内部に正常な体温で低融点のアガロースを注入します。シリンジをゆっくりと取り外し、針を内側に保ち、アガロースの逆流を防ぎます。
アガロースのゲル化を促進するために、肺に冷たいPBSを注ぎます。針を取り外し、鉗子で気管を固定して、固化していないアガロースの逆流を防ぎます。胸骨を切り開き、鉗子で気管を押さえ、ハサミで切ります。胸腔から肺を引き出します。メディア内のローブを分離します。顕微鏡観察のために生理学的条件下でイメージングウェル内に置きます。アガロースは、生きた細胞相互作用を観察するのに役立つ生理学的温度で肺の形態を維持します。次のプロトコルでは、がん細胞と間質細胞との間の相互作用を研究するための肺のex vivoライブイメージングを実演します。
- ex vivoライブイメージングのために肺を準備するには、まず、ソーカーで覆われた発泡スチロールの蓋にマウスを固定し、動物を70%エタノールで滅菌します。次に、外科用ハサミを使用して、皮膚を通して横方向の心窩部切開を行い、続いて腹膜を通して同様の切開を行います。次に、解剖ボードを垂直位置に移動し、下行大動脈を切断して、血液が胸腔ではなく腹部に溜まるようにします。
横隔膜の小さな開口部を切り取って真空を放出し、次に胸郭に沿って切開して横隔膜を切除し、肺を視覚化します。手術用ハサミを使用して、肋骨を無傷のままに、胸郭の上の気管まで皮膚を切り取ります。次に、胸郭から皮膚を分離し、気管自体を傷つけないように注意しながら、周囲の結合組織を切除して気管を露出させます。気管を完全に切らずに、軟骨輪に平行な露出した気管の直径約1ミリメートルの小さな開口部を、喉頭のできるだけ近くで切り取ります。
次に、20ゲージの針を4〜5ミリメートルの空気圧に逆力で静かに挿入します。針の端は気管を通して見えるはずです。シリンジに400マイクロリットルの37°Cの2%低融点アガロースを充填し、次いで鉗子で針を安定させる。解剖ボードを垂直に保ちながら、温かいアガロースの全量を針を通して肺にゆっくりと注入します。肺が膨らんだら、針を気管内に保持したままシリンジを取り外し、20°CのPBSを肺に約50ミリリットル注ぎ、アガロースをセットします。
アガロースが固まったら、針を取り外し、鉗子を使用して気管を閉じ、固化していないアガロースの漏れを防ぎます。次に、胸骨切開術で胸をさらに開き、鉗子で気管をつかみます。次に、外科用ハサミを使用して、気管を完全に切り抜きます。肺を摘出するには、気管をそっと引き上げ、結合組織と食道を切り取り、肺を胸腔から完全に引き出します。
組織を摂氏37度のRPMI1640に浸して、余分な血液を洗い流します。ハサミと鉗子を使用して、葉の主幹気管支を門部で切断し、肺葉を静かに分離します。ローブを24ウェルイメージングプレートの平坦な表面の1つのウェルに移し、組織を摂氏37度のRPMI 1640の100マイクロリットルで覆います。ローブの上に15ミリリットルの円形顕微鏡カバースライドを数枚置いて浮かないようにし、温かいPBSを周囲のウェルに注いで培地が蒸発するのを防ぎます。次に、24ウェルプレートをクライメートチャンバーに挿入し、チャンバーを共焦点顕微鏡ステージに移します。