CAFsを用いた肺がん細胞の3D共培養:腫瘍進行を研究するためのIn Vitroモデルシステム

- 3D共培養では、天然の細胞外マトリックス微小環境を模倣した基底膜マトリックスのようなマトリックスで複数の細胞タイプを一緒に増殖させ、細胞間および細胞マトリックス間の相互作用を促進します。2つに取られた癌関連線維芽細胞またはCAFと肺癌細胞の均一な懸濁液を調製し、基底膜マトリックスに埋め込まれた3D共培養を確立する。周囲温度でのマトリックスの固化を防ぐために、懸濁液を氷上に保持します。

適量の懸濁液を細胞培養プレートに移します。37°Cで必要な時間インキュベートし、細胞をマトリックスに共包包します。オーバーレイ3D共培養を確立するには、基底膜マトリックス中に肺がん細胞の懸濁液を所望の細胞密度で調製します。サスペンションを氷上で維持します。この細胞マトリックス懸濁液を適量ピペットで細胞培養プレートに注入します。摂氏37度でインキュベートして、埋め込まれたがん細胞の単一培養をセットアップします。

その後、好ましい培養培地に懸濁した所望の量のCAFを、埋め込まれたがん細胞上に移します。3D共培養では、CAFはがん細胞のスフェロイド形成を促進し、がん細胞を引き付けて、涙滴のような構造をもたらします。このプロトコルでは、TUM622 肺がん細胞と CAF を共培養して、それらの相互作用を研究します。

- TUM622およびCAFの細胞懸濁液を調製した後、前述のように、10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルーを混合してCAF細胞密度を数えます。血球計算盤の2つのチャンバーのそれぞれに10マイクロリットルの混合物を加えて、細胞密度をカウントおよび計算します。TUM622 細胞と CAF を基底膜マトリックスに共埋めするには、まず、細胞密度情報に基づいて、プレーティングに使用する細胞の所望の数を計算します。CAFは、TUM622細胞の2対1の比率で播種されます。TUM622 の計算容量と CAF 細胞懸濁液を同じ遠心分離チューブに移します。スピンダウンして、すべての媒体を吸引します。基底膜マトリックスに再懸濁し、混合物の310マイクロリットルを24ウェルプレートの各ウェルにプレート化します。免疫蛍光法では、前述のように60マイクロリットルのTUM622とCAFの混合物をチャンバースライドに移します。

TUM622を基底膜マトリックス中のCAFと重ね合わせて共培養するには、まず前述のようにTUM622モノカルチャーを設定します。CAF懸濁液の2倍を遠心チューブに移し、室温で5分間「g」の300倍でスピンダウンします。上清を吸引し、CAFを1ミリリットルの3D培地に再懸濁します。1ミリリットルのCAF懸濁液を、埋め込まれたTUM622細胞を含むウェルに移します。