用量増量前にIC50の決定が不可欠であるのはなぜですか？

MTTアッセイによってベースラインのIC50を決定することで、1/10 IC50から用量漸増を開始するための基準濃度が得られ、即座に細胞毒性を引き起こすことなく選択圧をかけることが可能になります。これにより、急激な細胞死ではなく、時間をかけた段階的な耐性獲得を誘導できます。

MTTアッセイの出力結果は、耐性の進展についてどのような情報を提供しますか？

MTTアッセイでは、生存細胞のミトコンドリア還元酵素活性によるホルマザン生成を測定し、570 nmにおける光学密度を細胞数と相関させます。当初は増殖を抑制していたアファチニブ濃度の段階的な上昇においても、細胞が生存能を維持している場合に耐性が確認されます。

耐性細胞株構築の確実な再現を可能にするものは何ですか？

亜合流状態での段階的な用量増加（継代ごとに濃度を10-20%増加させる）により、標準化された選択圧プロトコルが提供され、異なる研究室間でも再現可能な同遺伝性の耐性モデルを構築することができます。

なぜ、機能横断的なコラボレーションにおいて再現性の要件が不可欠なのですか？

繰り返し実験において一貫した耐性獲得が認められることで、観察された表現型が確率的なものではなく遺伝的に駆動されたものであることが保証され、標的バリデーション研究に向けた、創薬探索からアッセイ開発、そして前臨床チームへの信頼性の高い引き継ぎが可能になります。

耐性の獲得を確認するためにどのような統計解析が必要ですか？

親細胞と投与量を段階的に上げた細胞の間でMTTアッセイによる生存率曲線を比較することで、耐性を確認します。この際、時間の経過とともに薬物感受性が低下したことを示すために、統計的な有意性検定（例：IC50シフト解析）が必要です。

用量漸増:がん細胞における薬剤耐性の発現法

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

0 閲覧数 • 4:17 分 • April 30th, 2023

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- チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は、キナーゼ受容体がATPに結合するのをブロックし、リン酸化を防ぎます。まず、がん細胞を増殖培地にプレーティングします。それらが好ましい密度に達するのを許し、細胞を複数のウェルに移します。一晩成長した後、複数のウェルで異なる薬物濃度を分注し、細胞を所望の期間増殖させます。水溶性色素であるMTTを添加して、細胞の生存率を測定します。ミトコンドリア酵素は、生細胞内でMTTを不溶性の紫色のホルマザンに変換します。

適切な可溶化剤を添加して反応を停止し、ホルマザンを分光光度法で測定します。この方法はMTTアッセイと呼ばれます。薬物濃度に対してホルマザンで示された生細胞のグラフをプロットします。ソフトウェアを使用して細胞の50%を殺す薬物濃度を見つけることにより、阻害濃度IC₅₀を計算します。

次に、増殖培地でがん細胞を増殖させ、3つの異なるプレートに分配します。細胞がサブコンフルエントに達したら、IC₅₀濃度の1/10希釈液を加えます。細胞を増殖させ、MTTアッセイを実施します。薬物投与量を増やしながらこのプロセスを繰り返します。がん細胞は、タンパク質配列の突然変異により、TKIに対する耐性をゆっくりと獲得します。

次のプロトコルは、用量漸増によるPC9細胞におけるアファチニブ耐性の発達を示しています。

- 適切なアファチニブ耐性濃度を決定するために、摂氏37度および5%二酸化炭素で10センチメートルの細胞培養処理皿内の増殖培地でPC9細胞を培養する。PC9細胞を増殖培地濃度の1ミリリットルあたり4倍10〜4細胞で再懸濁し、96ウェルマイクロプレートにウェルあたり50マイクロリットルの細胞懸濁液で細胞を播種する。細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートした後、示された濃度の6回の繰り返しで、ウェルあたり50マイクロリットルのアファチニブ溶液で細胞を処理します。そして、細胞培養インキュベーターで96時間のインキュベーションを行った後、各ウェルに15マイクロリットルのMTT色素を加えます。

細胞培養インキュベーターで4時間後、各ウェルに100マイクロリットルの可溶化停止溶液を加え、プレートをインキュベーターに一晩戻します。翌朝、マイクロプレートリーダーで570ナノメートルの光学密度を測定します。アファチニブを連続的に曝露するには、10ミリリットルの増殖培地を含むP100皿でPC9細胞を、細胞がサブコンフルエンシーに達するまで培養します。

サブコンフルエントな培養物を、初期培養皿あたり9ミリリットルの成長培地からなる3つの新しいP100皿に移し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。翌朝、アファチニブの0.1ナノモルまたは半値阻害濃度の1/10を3つの培養皿の各セットに加えます。アファチニブ処理した細胞がサブコンフルエントになったら、1ミリリットルのピペットを使用して培養物を完全に混合し、各ディッシュから1ミリリットルの細胞を新しいP100皿の9ミリリットルの新鮮な増殖培地に移します。

新しい培養物に10%から20%高い濃度のアファチニブを追加し、10〜12か月の期間にわたって培養物がサブコンフルエントに達するたびに段階的に用量漸増してアファチニブ濃度を増加させます。アファチニブ濃度が1マイクロモルに達したら、実証されているようにMTTアッセイを実施して、細胞がアファチニブ耐性を発症したことを確認します。